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丁苯酞通过PGC-1α/Nrf2通路发挥对多发性硬化小鼠神经系统线粒体的保护作用

孟然  
【摘要】:目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种自身免疫性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,其基本病理改变为炎性细胞的浸润、髓鞘的脱失、轴索损伤。最新研究表明:1、多发性硬化早期致残和疾病进展与神经轴索损害程度相关,是中青年致残的主要病因之一。2、多发性硬化病程中不仅存在髓鞘和轴索损伤,还存在明显的线粒体形态及功能的损伤。发病早期即可出现氧自由基及其毒性产物大量产生,在造成神经纤维脱髓鞘及轴索变性的同时,可直接损伤线粒体,导致病变周围神经的能量代谢障碍,从而加重脱髓鞘及轴索损伤;在疾病亚急性期及恢复期,炎性反应程度减弱,此时线粒体处于瘫痪状态,氧化呼吸链断裂,供能障碍,最终导致轴索及神经细胞不可逆性损伤。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)活性成分为d1-3-正丁基苯酞,为脂溶性药物,可以直接通过血-脑屏障发挥作用。大量的临床及实验室研究已经证明其对缺血性脑血管病具有线粒体保护作用,本研究旨在了解实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠在疾病发生发展过程中线粒体功能变化,并进一步探讨丁苯酞对EAE小鼠线粒体的保护作用及机制,为临床治疗多发性硬化提供新的方法及实验依据。方法:选取60只8-10周龄C57BL/6小鼠,使用MOG35-55作为抗原免疫建立EAE模型。以EAE评分0.5分及以上为模型成功,选取发病小鼠54只,随机分为低剂量NBP组、高剂量NBP组、地塞米松组、EAE组,并设正常对照组。低剂量NBP组(NBP-L)12只、高剂量NBP组(NBP-H)12只、地塞米松组(DXM)12只、EAE组9只。随机选取6只正常小鼠为正常对照组。低剂量NBP组和高剂量NBP组小鼠分别腹腔注射丁苯酞80mg/kg/d,120 mg/kg/d。地塞米松组(DXM)小鼠给予地塞米松磷酸钠注射液0.07mg/kg/d腹腔注射;正常对照组及EAE组:小鼠每日腹腔注射等体积DMSO,共14天。分别于发病后第0天、第7天及第14天三个时间点观察C57BL/6小鼠自免疫后的精神状态、活动情况、发病情况及神经功能评分。随后处死小鼠取脊髓腰膨大组织。采用HE染色观察小鼠脊髓炎症细胞浸润情况,免疫组织化学染色法及实时定量PCR法测定小鼠脊髓腰膨大PGC-1a、Nrf2及Na+/K+ATPase m RNA的表达情况。结果:1动物发病及临床评分情况观察:小鼠大多数在免疫后第10天左右开始发病,在发病后第7至15天到达临床高峰。丁苯酞低剂量、丁苯酞高剂量及地塞米松组小鼠,临床评分最高平均出现在发病后7天,而EAE组小鼠临床评分最高出现在14天左右(Table.1),该结果提示干预用药后的小鼠临床症状较未用药小鼠轻,干预后小鼠自发病第七天开始好转,评分下降,而未用药小鼠则呈逐渐加重趋势。2实验室指标观察2.1 HE染色EAE组小鼠的脊髓组织中出现神经元细胞凸起减少,染色变淡,甚至有细胞破裂现象;同时有大量淋巴细胞及单核细胞浸润在小血管周围,呈“袖套样”改变,丁苯酞低剂量、丁苯酞高剂量及地塞米松组小鼠脊髓组织中相较于正常小鼠出现轻度神经元细胞的受损,可见淋巴细胞及单核细胞浸润,但浸润严重程度低于EAE组小鼠,未形成较为典型的“袖套样”改变。2.2免疫组化染色2.2.1各组小鼠PGC-1a免疫组化情况EAE0组、EAE7、EAE14和D7组阳性细胞数均低于正常对照组(P0.05),D14组阳性细胞数高于D7组(P0.05),NBP-L14及NBP-H14组阳性细胞数均高于EAE14组(P0.05),NBP-L7和NBP-H7表达无明显差异(P0.05),NBP-L14和NBP-H14表达无明显差异(P0.05)。2.2.2各组小鼠Nrf2免疫组化情况EAE各组阳性细胞数均低于正常对照组(P0.05),NBP及DXM各组阳性细胞数均高于EAE0组(P0.05),NBP及DXM各组阳性细胞数均高于EAE7组(P0.05),NBP-L14、NBP-H14及D14组表达均高于EAE14组(P0.05),D14组阳性细胞数均高于D7组(P0.05),NBP7天组与DXM7天组相比均无明显差异(P0.05),NBP14天组与DXM14天组相比均无明显差异(P0.05)。2.2.3各组小鼠Na+/K+ATPase免疫组化情况EAE0及EAE7组阳性细胞表达数均低于正常对照组(P0.05),D7、NBP-H14及D14组阳性细胞表达均高于EAE7组(P0.05),D7组表达高于EAE0组(P0.05),D7、NBP-H14及D14组阳性细胞表达均高于NBP-L7组(P0.05),NBP-L7组与NBP-H7组表达无明显差异(P0.05),NBP-L14组与NBP-H14组表达无明显差异(P0.05),DXM各组间无明显差异(P0.05)。2.3 real-time PCR2.3.1小鼠脊髓组织中PGC-1αmRNA表达情况EAE0、EAE7、NBP-L7、NBP-L14、NBP-H14、DXM7及DXM14表达均低于正常对照组(P0.05),NBP-L14、NBP-H7及D14组表达均高于EAE0组(P0.05),NBP-H7、NBP-L14与D14组表达均高于EAE7组(P0.05),NBP-L7与NBP-H7组相比结果无明显差异(P0.05),NBP-L14与NBP-H14组相比结果无明显差异(P0.05)。2.3.2小鼠脊髓组织中Nrf2 m RNA表达情况EAE各组、NBP-L7、NBP-H7、DXM7及DXM14表达均低于正常对照组(P0.05),NBP-L7、NBP-H7组表达均高于EAE各组,(P0.05),NBP-L14与NBP-H14组表达均高于EAE14组(P0.05),NBP-L7与NBP-H7组间表达无明显差异(P0.05)。2.3.3小鼠脊髓组织中Na+/K+ATPase mRNA表达情况EAE0、EAE7、EAE14、NBP-L7、NBP-H7、NBP-L14、NBP-H14及DXM14表达均低于正常对照组(P0.05),NBP-L14及NBP-H14组均高于EAE7组(P0.05),DXM14天组表达高于EAE14天组(P0.05),NBP-L7与NBP-H7组间表达无明显差异(P0.05),NBP-L14与NBP-H14组间表达无明显差异(P0.05)。(Fig.13)结论:1 EAE发病过程中伴随PGC-1α、Nrf2及Na+/K+ATPase降低。2丁苯酞能够作用于PGC-1α/Nrf2通路增加PGC-1α及Nrf2表达,促进线粒体增殖功能,增加Na+/K+ATPase含量,从而发挥神经保护作用。3地塞米松可以在一定程度缓解EAE炎症,改善症状,但因其副作用较大,疗效并无明显优势,因此丁苯酞治疗更为有益。


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