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Illumina高通量测序技术观察剖宫产儿肠道微生物群的演替

陈青霞  
【摘要】:目的:肠道微生物与人体健康息息相关。机体与肠道微生物群间存在多层面互惠互利的共生关系,肠道微生物群在帮助消化吸收、抵抗致病微生物定植,促进免疫系统发育和成熟上均发挥着重要作用。婴儿期是肠道微生物群体系建立的关键时期。分娩方式是影响肠道微生物群的初始定植的重要因素,此时期肠道微生物群紊乱可能与远期如过敏、肥胖等多种疾病发生风险增加有关。目前的对肠道微生物群的研究多应用传统的分子生物学技术,如实时荧光定量PCR和变性梯度凝胶电泳DGGE,这些方法不仅耗时而且工作量大,只能检测出一定丰度以上的微生物,对复杂的肠道微生物群的研究不够全面。Illumina高通量测序技术能够测序肠道中所有微生物DNA序列,全面分析肠道微生物落的多样性和丰度,满足对肠道微生物群落的全面认识。本研究采用Illumina Miseq平台对剖宫产儿生后肠道微生物群的初始定植和演替进行动态随访观察,目的为完善和补充以往我们在此方面的研究内容,为剖宫产儿肠道微生物群落的演替与远期机体健康和疾病的关系的研究提供理论依据。方法:收集2013年11月-2014年12月在河北医科大学第三医院产科、石家庄市第四医院产科分娩的符合入选标准的足月健康剖宫产儿30例。其婴儿及双亲均生活在石家庄市或其周边县市,气候环境,居住环境相当。所有入选对象均在研究开始前签订知情同意书,并获河北医科大学第三医院伦理道德委员会同意。收集入组婴儿出生后第1、3、7天,第1个月、3个月和6个月龄(分别设定为T1-T6组)时的粪便标本冻存于-80℃冰箱。随访入组婴儿各时间段的喂养状况、生长发育情况以及用药情况(抗生素及益生菌制剂)。采用E.Z.N.A.#174;Stool DNA Kit试剂盒提取婴儿粪便微生物的总DNA,并扩增16S r RNA基因的V3+V4可变区,应用IlluminaMiseq平台测序,全面分析肠道微生物群的构成,丰度和多样性。结果:1入组剖宫产儿共30例,分别采集生后第1、3、7天,第1个月、3个月和6个月龄时这6个时间点粪便标本,应收集标本180份,因各种原因实采样本160份,脱落20份,脱落率为11.1%,其中编号为3、5、36、46、107、132、138,因标本DNA扩增失败,共计153个样本进入后续的高通量测序分析。对153份剖宫产儿粪便样本测序发现,共获得2450420个有效序列,在经过过滤处理后得到优化序列数为1892051,总碱基数870289641bp,平均459.97bp。2稀释曲线表明本研究测序深度足够,能覆盖肠道微生物群97%的菌种。多样性分析提示生后随时间推移粪便样本中菌群丰度及多样性逐渐增加。3对153份剖宫产儿粪便样本测序:在门水平上共检测出14个菌门,其中98%-99%以上主要为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)及Candidate division TM7五个菌门。4 30例剖宫产儿粪便微生物群的定植及演替:153份粪便样品进行测序共测得183个菌属。属水平上,T1组粪便菌群定植分布相对均匀,样本间差异小,以乳球菌属(Lactococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)及Solibacillus等需氧菌和兼性厌氧菌为优势菌属;T2组粪便微生物群构成较T1组发生明显变化,以埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)等兼性厌氧菌为优势菌群,乳球菌属、芽孢杆菌属等所占比例少。T3组粪便标本个体间差异较大,双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium sensustricto)、肠球菌属(Enterococcus)及韦荣球菌属(Veillonella)定植增多,埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)定植减少。T4组粪便标本中双歧杆菌属(Bifidobacterium)定植增至24.5%,克雷伯杆菌属(Klebsiella)减少至20%左右,梭状芽胞杆菌属(Clostridium sensustricto)占10%左右。T5组粪便标本中双歧杆菌属(Bifidobacterium)和埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)为优势菌属,克雷伯杆菌属(Klebsiella)及梭状芽胞杆菌属(Clostridium sensu stricto)定植减少。T6组粪便标本间菌属分布趋于均匀,以双歧杆菌属为优势菌属。埃希氏菌属(Escherichia-Shigella)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)及梭状芽胞杆菌属(Clostridium sensu stricto)仍存在。结论:1 Illumina Miseq测序平台能够测序肠道中所有微生物DNA序列,全面分析肠道微生物落的多样性和丰度,满足对肠道微生物群落的全面认识。2对剖宫产儿肠道微生物群进行了全面分析:(1)在门水平上,共检测出14个菌门,98%-99%以上主要为5个菌门,分别为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)及Candidate division TM7。(2)在属水平上共测得183个菌属,主要有埃希氏菌属、双歧杆菌属、克雷伯氏菌属、梭状芽胞杆菌属、韦荣球菌属、乳球菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属等。3动态随访观察了剖宫产儿生后肠道微生物群的初始定植、分布和演替3.1门水平上,剖宫产儿生后6个月内优势菌门为厚壁菌门和变形菌门,丰度较高,其次还有放线菌门和拟杆菌门。出生后随时间推移,厚壁菌门和放线菌门是增加的;变形菌门和拟杆菌门是降低的。3.2属水平上,剖宫产儿出生后第1天粪便样本已有大量细菌定植,主要为乳球菌属、芽孢杆菌属及假单胞菌属等需氧菌和兼性厌氧菌,其大量生长繁殖消耗消化道内大量氧气,降低了肠道内酸碱度和氧化还原电位,为后期厌氧菌的定植打下基础,也表现出后期需氧菌和兼性厌氧菌定植的急剧减少,专性厌氧菌如双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属、肠球菌属及韦荣球菌属的快速定植,表现在生后第1个月时双歧杆菌属明显增加,至6个月龄添加辅食后肠道菌群的多样性和丰度增加,双歧杆菌属成为肠道优势菌。


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