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《河北医科大学》 2015年
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HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清对肝细胞生物学性状的影响

卢文冉  
【摘要】:目的:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)是引起肝脏疾病的重要病原体,感染者大部分发展为慢性感染,最后可导致肝纤维化,肝硬化和肝癌,而且目前还没有有效的疫苗来预防HCV的感染。聚乙二醇化干扰素-α(pegylated interferonα,PEG-IFN-α)和利巴韦林(ribavirin,RBV)是治疗丙肝的最佳药物,但仍有约为30%-50%的HCV感染者对该联合抗病毒治疗无效。HCV core蛋白是病毒感染肝细胞后第一个表达的蛋白,在感染的靶细胞和患者的血清中均可检测到其存在。HCV core蛋白不仅参与病毒颗粒的组装,还可与靶细胞不同蛋白相互作用调节靶细胞的功能,包括细胞的增殖,生长,凋亡等。固有免疫应答是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,肝脏组织中的库否氏细胞是重要的固有免疫应答细胞,属于定居的巨噬细胞,参与机体的免疫防御。目前认为,巨噬细胞是一类异质性很强的细胞群体,在组织微环境中可被刺激分化为具有不同功能的细胞亚群。包括经典活化的M1巨噬细胞、旁路活化的M2巨噬细胞、肿瘤相关的巨噬细胞等。本室前期结果研究发现,HCV core蛋白可刺激巨噬细胞THP1分泌促炎和抑炎因子,因此,本研究拟通过收集HCV core蛋白作用的THP1上清,从不同的角度观察培养上清对正常肝细胞株L02、肝癌细胞株(Hep G2、SMCC-7721)的增殖、迁移、侵袭以及对干扰素作用的影响,并初步探讨其机制,为进一步研究HCV core蛋白对巨噬细胞活性的影响提供实验依据。方法:1构建与表达重组HCV core蛋白从JFH-1株(HCV2a)全长基因质粒上通过PCR的方法扩增HCV core基因,连接至p MD18-T载体上,测序正确后,经Bam HⅠ,HindⅢ双酶切,与p ET28a相连,构建重组原核表达质粒p ET28a-HCV core,双酶切鉴定。经IPTG 37℃诱导获得表达core蛋白的包涵体,经纯化,复性和浓缩后,行SDS-PAGE和Western blot鉴定。2获得HCV core蛋白作用的巨噬细胞m-THP1培养上清PMA(10 ng/ml)诱导人单核细胞株THP1分化为巨噬细胞m-THP1,HCV core蛋白以20μg/ml刺激m-THP1 24h后收集上清,离心。-80℃保存备用。同时设PBS阴性对照组与加HCV core蛋白无细胞的空白对照组。3观察细胞培养上清对肝细胞生物学行为的影响将收集的细胞培养上清用完全培养基20%或50%稀释后分别培养人正常肝细胞L02、肝癌细胞Hep G2或SMMC7721细胞:1)通过细胞增殖实验(CCK8法),划痕实验,Transwell细胞迁移实验及克隆增殖实验观察稀释后的培养上清对上述肝细胞细胞增殖,迁移能力的影响;2)通过实时定量PCR检测三种肝细胞株MMP2和MMP9基因的表达变化;3)Westernblot检测三种肝细胞内转录因子NF-κBp65及MAPKs通路相关蛋白(ERK,JNK,p38)的表达。4观察细胞培养上清和IFN-α对肝细胞增殖的影响在96孔细胞培养板中分别培养L02、Hep G2和SMCC7721三种肝细胞,待细胞贴壁后更换培养基(含IFN-α1000 U/孔),1h后加入不同组分的细胞培养上清,使各孔终体积均为200 ul,分别在刺激肝细胞24h、48h时检测其增殖变化。以了解在core蛋白作用的THP1产物对干扰素抗病毒作用的影响。设组情况如下:core蛋白作用的THP1的细胞培养上清+IFN-α刺激组为实验组,同时设IFN-α单独刺激组、core蛋白作用的THP1细胞培养上清刺激组、THP1的细胞培养上清+IFN-α刺激组为对照组。结果:1构建原核表达质粒p ET28a-HCV core(含有2个His标签),经Bam HⅠ,HindⅢ双酶切后琼脂糖凝胶电泳有约575bp大小片段存在,测序结果显示与Genbank记载序列一致。2获得原核表达重组蛋白HCV core,纯化后经SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示获得分子量约为21KD的单一条带,并测得其浓度为0.5μg/μl。3 HCV core蛋白作用的m-THP1细胞培养上清明显促进肝细胞的增殖、迁移和侵袭:1)与对照组相比,50%稀释的细胞培养上清时可促进L02、Hep G2以及SMMC7721细胞的增殖(P0.05);2)在划痕实验和迁移试验中,与对照组相比,20%稀释的细胞培养上清能够明显促进SMMC7721细胞的迁移(P0.01),50%稀释的细胞培养上清可明显促进L02细胞的迁移(P0.01),两种浓度的细胞培养上清对Hep G2细胞的迁移无影响。在平板克隆形成试验中,对三种细胞均无明显影响。4 HCV core蛋白作用的m-THP1细胞培养上清可干扰IFN-α抑制肝细胞增殖的作用:与对照组相比,IFN-α(1000 U/孔)可明显抑制肝细胞的增殖,而core蛋白作用的m-THP1的细胞培养上清能够干扰IFN-α的这种抑制作用,促进细胞的增殖。5实时定量PCR结果显示:与纯粹的m-THP1的细胞培养上清和HCV core空培养基对照组相比,20%稀释的核心蛋白刺激下的m-THP1上清作用可显著促进SMMC7721细胞MMP9的表达(P0.05);L02和Hep G2细胞MMP9和MMP2的表达水平与对照组相比并无显著变化。6 core蛋白作用m-THP1细胞培养上清作用SMMC-7721细胞,检测相关蛋白表达的变化,Western blot结果显示,与PBS作用m-THP1的细胞培养上清和HCV core空培养基对照组相比,core蛋白作用m-THP1细胞培养上清后可使p-ERK的表达明显降低,p-38的表达并无明显变化,磷酸化的NF-κB65表达升高。结论:1成功构建、表达了HCV core蛋白。2 HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清可促进L02、Hep G2、SMMC-7721的增殖;促进L02、SMMC-7721的迁移可能与NF-κB存在一定关联。3 HCV core蛋白作用的巨噬细胞培养上清可降低L02、Hep G2、SMMC-7721对IFN-α的敏感性。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R512.63

【参考文献】
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【二级参考文献】
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