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丁苯酞对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠Na+/K+ATPase、ERK1/2表达的影响

张瑞丹  
【摘要】:目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种中枢神经系统常见的慢性炎症性脱髓鞘疾病,以髓鞘脱失、轴索病变、炎性细胞浸润、神经胶质细胞增生和进行性神经功能障碍为主要特点,好发于青年人,目前尚缺乏有效的治疗方法,致残率高。丁苯酞(dl-3n-butlphalide,NBP)是我国脑血管疾病治疗领域中第一个拥有自主知识产权的国家级一类新药,是首个在国际上通过作用于多个靶点及多个环节来治疗缺血性脑卒中的一种创新药物。临床药效学研究表明,丁苯酞具有保护线粒体功能和增加缺血区灌注的作用,可阻断缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理环节,具有较强的抗脑缺血作用,可明显减小梗死面积,减轻梗死后脑水肿,改善神经功能缺损,起到脑组织保护作用。基于丁苯酞的对缺血性脑病的研究基础,我们推测丁苯酞是否可通过保护线粒体而对多发性硬化起到一定的预防和治疗作用?但目前尚未见关于该方面的研究及报道。故本课题拟采用人类多发性硬化的经典模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠作为研究对象,通过腹腔注射不同剂量丁苯酞注射液进行药物干预,动态观察EAE小鼠不同发病阶段中临床病情及脊髓组织中线粒体Na+/K+ATP酶及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)表达水平的变化,探讨丁苯酞是否对EAE有治疗作用及可能的机制,为临床多发性硬化的治疗提供新的思路和方法,同时为扩展丁苯酞的临床应用范围提供更多的实验依据。方法:以完全弗氏佐剂+小剂量MOG35-55为抗原乳剂免疫诱导C57BL/6小鼠来制作EAE模型。EAE模型制作成功后将发病小鼠随机分为4组,即EAE组、丁苯酞低剂量干预组(NBP-L组)、丁苯酞高剂量干预组(NBP-H组)及地塞米松组(D组),并于发病当天(0天)开始进行药物干预,丁苯酞各组分别给NBP-L组小鼠腹腔注射丁苯酞80mg/kg/天、NBP-H组小鼠腹腔注射丁苯酞120mg/kg/天、D组小鼠腹腔注射地塞米松磷酸钠0.07mg/kg/天,3组均连续注射14天,EAE组不做特殊干预,同时取正常小鼠9只设为正常对照组(n组)。观察各组小鼠的发病情况、体重变化和神经功能障碍情况,并采用国际通用的benson(5分)评分标准进行神经功能评分。于发病当天(0d),药物干预后第7天(7d)、第14天(14d)处死小鼠并取脊髓腰膨大部位组织后,以实时定量pcr(rt-pcr)方法观察小鼠脊髓腰膨大组织erk1/2mrna及na+/k+atpasemrna表达情况;以免疫组化法观察na+/k+atpase的表达情况。采用spss13.0统计软件处理各组数据,各组计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组比较应用单因素方差分析,计数资料组间比较用卡方检验;两组间比较用student’st-检验,均以p0.05为有统计学意义。结果:1各组小鼠临床症状观察:发病后第7天,nbp-l组、nbp-h组、d组小鼠的神经功能评分均显著小于同时期eae组小鼠(p0.05);nbp-l组、nbp-h组、d组间比较,小鼠神经功能评分无明显差异(p0.05)。发病后第14天,nbp-l组、nbp-h组、d组小鼠的神经功能评分均显著小于eae组小鼠,有统计学意义(p0.05);nbp-l组、nbp-h组、d组间比较,小鼠神经功能评分无明显差异(p0.05)。2eae组小鼠第0、7、14天的神经功能评分与脊髓组织的erk1/2表达水平相关性分析结果:r=-0.9914,ν=1,查t界值表得0.025﹤p﹤0.05。按α=0.05的水准,eae组小鼠的神经功能评分与其脊髓组织的erk1/2的表达水平之间有负的直线相关关系。3实验各组小鼠脊髓组织于0天、7天、14天时erk1/2的表达水平比较:0天即eae模型小鼠发病当天时,其脊髓erk1/2mrna的表达水平显著低于正常对照组,差异有统计学意义(p0.05)。发病及药物干预后第7天,eae7组较eae0组比较,erk1/2表达水平无明显变化(p0.05);nbp-h7组与eae7组比较,其erk1/2mrna表达水平明显增高,差异有统计学意义(p0.05);nbp-l7组、d7组分别与eae7组比较,erk1/2mrna表达水平均无明显变化(p0.05)。发病及药物干预后第14天,eae14组小鼠脊髓erk1/2mrna表达水平均明显低于eae7组和eae0组(p0.05);nbp-h14组、d14组分别与eae14组比较,其erk1/2mrna表达水平均明显增高,差异有统计学意义(p0.05);nbp-h14组小鼠脊髓erk1/2mrna表达水平又明显高于D14组(P0.05)。4各组小鼠脊髓线粒体Na+/K+ATPase免疫组化结果比较:EAE组、NBP组及D组各亚组Na+/K+ATPase阳性细胞表达数均低于正常对照组(P0.05),但NBP组及D组各亚组Na+/K+ATPase阳性细胞数均高于同期EAE各组(P0.05),D组各组又均高于同期NBP各组(P0.05),NBP14天组表达高于NBP7天组(P0.05),但NBP各组不同剂量间Na+/K+ATPase表达未见明显差异(P0.05)。5小鼠脊髓组织中Na+/K+ATPase mRNA表达情况(real-time PCR):EAE0、EAE7、EAE14、NBP-L7、NBP-H7、NBP-L14、NBP-H14及D14小鼠脊髓Na+/K+ATPase表达水平均低于正常对照组(P0.05),NBP-L14及NBP-H14组均高于EAE7、EAE14组(P0.05),DXM14天组表达高于EAE14天组(P0.05),NBP-L7与NBP-H7组间表达无明显差异(P0.05),NBP-L14与NBP-H14组间表达无明显差异(P0.05)。结论:1 EAE发病过程中伴随着线粒体的损伤,Na+/K+ATP酶的含量的降低;丁苯酞有减轻线粒体损伤的作用。2 EAE的病情严重程度与ERK1/2的表达水平存在着负性直线相关关系。3丁苯酞可能通过改善ERK1/2表达水平抑制线粒体通透性转换孔的开放,从而增加Na+/K+ATP酶的含量,保护线粒体功能,起到对神经组织的保护作用。4地塞米松通过抗炎作用可显著减轻线粒体损伤,但由于其副作用较大,从而降低了其治疗效果,而经综合考虑安全与有效性,丁苯酞对EAE治疗可能更为有益,尤其是长期口服可能获益更多。


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