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《河北医科大学》 2016年
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山奈酚通过Wnt3a/beta-catenin信号通路促进实验性脑缺血小鼠神经功能改善及神经再生

焦红蕾  
【摘要】:目的:脑卒中不仅会造成急性期脑损伤,由于损伤脑组织恢复不佳,也会引起极高的致残率。由于rt-PA过窄的时间窗及可能发生的严重并发症,溶栓治疗的普及受到很大的限制,因此脑卒中发生后的延迟脑保护治疗及其对神经功能恢复的影响越来越受到人们的关注。山奈酚(Kaempferol),属于常见的黄酮类化合物,主要来源于姜科植物山柰(Kaempferia galangal)的根茎,广泛存在于各种水果、蔬菜及饮料中,因其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多种功效而受到人们的广泛关注。已有实验证实其在脑卒中的急性期通过抗氧化抗炎等作用减缓颅内继发性脑损伤,促进预后,但对于这种药物对脑卒中延迟治疗效果及其是否可改善脑卒中后神经功能的恢复及可能的作用机制却研究甚少。成年哺乳动物脑内存在两个能产生大量神经元的生发区,分别为侧脑室的脑室下带(subventricular zone,SVZ)和海马的颗粒下带(subgranular zone,SGZ)。正常生理情况下,SVZ区和SGZ区仅有少量神经发生,以补偿生理的损失量。但在病理条件如脑缺血的情况下,SVZ区神经前体细胞被激活,其增殖明显增多并且可以迁移至缺血半暗带,分化成熟以替代梗死区受损的神经细胞,促进神经功能的修复。Wing1ess/integrase-1(Wnt)信号通路是广泛存在于多细胞真核生物中的信号通路,参与神经发育过程,包括神经诱导和图案化,细胞增殖,细胞极化,轴突导向,突触形成,成年神经再生和神经细胞的维护和迁移再生,并且在疾病发生状况下可被重新激活或抑制。Wnt3a是Wnt蛋白的主要成员,已有研究表明Wnt3a可以通过增加细胞核内β-catenin蛋白从而调控成年神经再生。脑源性神经营养因子(BDNF)已证实在生理和病理条件下均与脑内SVZ区神经前体细胞的增殖、分化及迁移紧密相关。但是,对于Wnt3a信号通路与BDNF表达的关系仍知之甚少。本文详细介绍了Wnt3a信号通路中相关蛋白的作用机制和Wnt3a信号通路对神经再生的影响,以及神经源性生长因子对于神经发生的作用。本实验旨在研究山奈酚的延迟性治疗可否促进缺血性脑卒中后恢复期神经功能的恢复和神经再生,且Wnt3a信号通路是否为该药物长时程应用的作用靶点。方法:采用永久性结扎右侧颈总动脉并在显微镜下烧灼右侧大脑中动脉的皮层分支以制备CD1小鼠局灶性脑缺血模型(MCAO)。实验用CD1小鼠随机分为假手术组(Sham),梗死组(MCAO),小剂量用药组(K-L),中剂量用药组(K-M),大剂量用药组(K-H)。各组小鼠分别于造模成功24小时后开始给予不同剂量的药物(25 mg/kg,50 mg/kg,100mg/kg)灌胃给药,MCAO组给予生理盐水灌胃。分别于术后7,14,28天对各组小鼠进行Rotarod评测神经功能,并且于术后14天用免疫荧光染色测定神经前体细胞增殖及分化的相关指标。造模成功后3,7,14天用免疫印迹(Western blot)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定Wnt3a信号通路上相关因子(Wnt3a,β-catenin,p-β-catenin)及BDNF的蛋白表达及基因表达。结果:1山奈酚改善了脑缺血小鼠的神经功能对假手术组(Sham组)、梗死组(MCAO组)、小剂量用药组、中剂量用药组、大剂量用药组分别于小鼠术后7,14,28天进行Rotarod神经功能评分。梗死后7天,各组小鼠均显示了神经缺损症状,各用药组神经功能学评分与梗死组相比有明显改善(P0.05)。这种改善在14天、28天时都有体现,但只有中剂量组在14天和28天具有统计学意义(P0.05)。用药组之中,中剂量用药组与小剂量用药组及大剂量用药组相比Rotarod神经功能评分在7天及14天明显增高,差异具有统计学意义(P0.05);在28天也有增高,但差异无统计学意义。2山奈酚通过介导Wnt3a/β-catenin信号通路促进脑缺血后神经再生BrdU是一种合成胸苷类似物,且在细胞复制时与DNA相结合。小鼠海马BrdU+细胞在脑缺血后1天开始增加,7天达到高峰并于28天恢复正常水平。Confocal结果显示,小鼠造模术后14天,用药组(之后实验中用药组剂量同中剂量用药组)同梗死组相比,梗死侧SVZ区的BrdU+细胞数显著增多,且具有统计学意义(P0.05)。在梗死区域的附近可以观察到Neu N、GFAP与BrdU的共标,说明在脑梗死发生后神经前体细胞不仅可以迁移至梗死区周边并能够分化为成熟的神经细胞以取代梗死区受损的神经细胞。3山奈酚上调Wnt3a、BDNF的蛋白及基因表达,增加了β-catenin/p-β-catenin的比例。Western blot,RT-qPCR检测结果显示:梗死后3、7、14天,梗死组小鼠梗死侧大脑皮层的Wnt3a、β-catenin的蛋白及基因水平上调,且β-catenin/p-β-catenin明显增高。药物干预后,其梗死侧皮层Wnt3a蛋白及基因水平较梗死组在3天、7天和14天时都相比上调,且差异具有统计学意义(P0.05)。用药组的β-catenin/p-β-catenin较梗死组在3天,7天及14天也均有显著意义的增高。而神经生长因子BDNF在梗死后第3天在蛋白或者基因水平同梗死组相比均具有统计学差异(P0.05)。在第14天在用药组及梗死组之间的蛋白表达及基因水平明显增高,其蛋白表达增高具有统计学差异(P0.05),而基因水平未有统计学意义。但而第7天在梗死侧皮层用药组及梗死组的表达无论蛋白或基因水平均有增高但无统计学差异。结论:长时程山奈酚治疗可显著促进脑梗死小鼠的神经功能恢复,同时可促进梗死侧SVZ区神经前体细胞的增殖、分化和迁移,其机制可能是通过激活Wnt3a/β-catenin信号通路,从而上调BDNF的表达而诱导神经再生过程的。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R743.3

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