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壳聚糖/海藻酸钙复合敷料影响血小板活性及黏附的作用机制研究

高洁  
【摘要】:目的:前期开发了壳聚糖/海藻酸钙复合敷料,对大体动物股动脉出血显示出良好的止血作用,有望为临床手术或应急现场救援提供一种有效的动脉止血敷料,但其凝血机制尚未清楚。血小板黏附是血小板发挥生理功能的初始步骤,因而促进血小板黏附对于生物活性材料发挥止血作用具有重要意义。本课题探讨该复合敷料对血小板活性及黏附的影响及作用机制,为其临床应用提供理论依据。方法:1实验分组:空白对照组(Control);壳聚糖组(CS);海藻酸钙组(Alg-Ca);壳聚糖/海藻酸钙复合敷料组(CS/Alg-Ca);2分步离心法制备浓缩血小板血浆;3扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)结合乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量测定考察血小板黏附情况;4采用流式细胞技术检测P-选择素(P-Selectin,CD62p)和整合素(CD61)的表达;5采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血浆中血栓素B_2(thromboxane B_2,TXB_2)含量;6实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测血小板中与血小板聚集和黏附等功能相关的CD63、Yes1、Pafah1b2、Pecam1、Lamp1、CD40Lg基因表达;7荧光分光光度法检测血浆中ATP和血小板内游离钙离子含量。结果:1 SEM结合LDH检测结果:CS组黏附血小板数量少,但伪足伸展呈激活状态;Alg-Ca组黏附血小板数量多,但多呈圆形未激活状态;CS/Alg-Ca组黏附血小板数量多且呈激活状态。2流式细胞术检测结果与Control组相比,CS组血小板膜蛋白CD62p水平无明显变化,Alg-Ca组和CS/Alg-Ca组CD62p水平均显著升高。与Control组相比,CS组CD61有所升高,Alg-Ca组CD61有所下降,CS/Alg-Ca组CD61与CS组水平基本一致。3 ELISA检测TXB_2含量发现CS/Alg-Ca复合敷料能够提高血浆中TXB_2含量(P0.05)。4 qPCR检测结果CS组CD63表达水平升高(P0.05),CS下调Yes 1、Pecam 1、CD40Lg的基因水平(P0.05),而显著上调Lamp1的基因水平(P0.05)。Alg-Ca下调CD63、Yes 1、Pecam 1、CD40Lg的基因水平(P0.05),但可以上调Pafah1b2基因水平(P0.05)。CS/Alg-Ca复合物与Alg-Ca相比能够上调CD63基因的表达(P0.05),下调Yes 1、Pecam 1的基因水平(P0.05),与CS和Alg-Ca相比,能上调CD40Lg的基因水平(P0.05)。5荧光探针检测血浆中ATP和细胞内游离钙离子含量发现CS/Alg-Ca并不能提高血浆中ATP含量和游离钙离子含量。结论:1 CS/Alg-Ca具有较好的血小板黏附作用,此作用与黏附早期Alg-Ca升高CD62p表达和黏附中后期升高CD61表达有关。2 CS/Alg-Ca复合敷料能够提高PRP中TXB_2含量。3 CS/Alg-Ca复合敷料对CD63黏附基因的表达量相对Alg-Ca提高而有利于血小板活化,而下调原癌基因Yes1、Pecam1的基因水平(P0.05),相对CS和Alg-Ca显著上调CD40Lg的基因水平(P0.05)。4 CS/Alg-Ca并不能提高血浆中ATP含量及血小板中游离钙含量。


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