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《河北医科大学》 2018年
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红豆杉科植物中抗人肺癌细胞增殖活性成分及作用机制研究

王思明  
【摘要】:东北红豆杉(Taxus cuspidata)和加拿大红豆杉(Taxus canadensis)为红豆杉科红豆杉属植物。从红豆杉属(Taxus)植物中分离得到的二萜类紫杉烷成分紫杉醇(Taxol)因其在临床上的显著抗肿瘤活性和独特的作用机理令世人嘱目。但是,紫杉醇在临床应用上依然存在耐药现象和毒副作用大等诸多问题,因此,为寻找活性更强且天然结构更简单的类似物或替代分子,当今研究的热点围绕着紫杉烷类化合物构-效关系探讨以及结构改造。本研究以从红豆杉科植物中分离纯化的16种紫杉烷类化合物为对象,筛选出三种具有抑制人肺肿瘤细胞增殖的化合物,并对其抗肿瘤细胞增殖的作用机制进行了初步探讨,为开发抗癌活性强,毒副作用低的新型药物奠定基础。第一部分紫杉烷化合物体外抗人肺肿瘤细胞增殖活性的筛选目的:以东北红豆杉和加拿大红豆杉小枝和针叶中分离纯化得到的16种二萜类紫杉烷化合物(1)7-deacetyltaxine B、(2)taxinine L、(3)5a,9a,10b,13a-tetrahydroxy-4(20),11-taxadiene、(4)taxinine M、(5)taxuspine X、(6)2a,9a,10b-triacetyl-5-cinnamoyltaxicin I、(7)taxinine A、(8)2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II、(9)dicyclotaxane-5α,9α,13β-triol、(10)4a,10β,13a-triacetoxy-15-benzoyloxy-2a,20β-epoxy-11(15→1)abeotax-11-ene-5a,7β,9a-triol、(11)4a,7β,9a,10β,15-pentaacetoxy-2a,20β-epoxy-11(15→1)abeo-taxa-11-ene-5a,13a-diol、(12)7,9,10,13-tetraace-toxy-5-[3’-(N-formyl-N-methyl-amino)-3’-phenylpropanoyl]oxytaxa-4(20),12-diene、(13)7,9,10,13-tetraace-toxy-5-[3’-(N-formylN-methyl-amino)-3’-phenylpropanoyl]oxytaxa-4(20),12-diene、(14)2α,7β,9α,10β,13-pentaacetoxy-11β-hydroxy-5α-(2’-hydroxy-3’-N,N-dimethylamino-3’-phenyl)-propionyloxytaxa-4(20),12-diene、(15)7β,9α,10β-triacetoxytaxa-4(20),12-diene-2α,5α,11β-triol和(16)4α,10β,13α-acetoxy-2α-benzoyloxy-7β,9α-epidioxy-5β,20-epoxytax-11-en-1β-ol为研究对象,对五种人肺肿瘤细胞增殖的抑制作用进行实验研究,以筛选出具有显著抑制人肺肿瘤细胞增殖作用的化合物。方法:利用4-甲基偶氮唑蓝法检测16种紫杉烷类化合物对五种人肺肿瘤细胞增殖的抑制作用,筛选出具有显著抑制人肺肿瘤细胞增殖作用的化合物,并探讨了紫杉烷类化合物抑制肿瘤细胞增殖的构-效关系。结果:10μmol/L的16种紫杉烷类化合物用相同的浓度作用于五种人肺癌细胞(QG-90、PC-6、A549、RERF-LC-kj和QG-56)后,化合物6、8和16对QG-90、PC-6和RERF-LC-kj细胞均显示强于阳性对照紫杉醇的增殖抑制活性,细胞生存率分别为9.77%、10.37%、18.08%,7.97%、16.38%、9.62%和36.89%、10.52%、32.79%;对A549和QG-56细胞的增殖抑制活性相同或低于阳性对照紫杉醇,细胞生存率分别为19.42%、28.80%、38.36%和21.72%、30.28%、2.96%;其他的紫杉烷类化合物1~5、7和9~15对五种肿瘤细胞的增殖显示较低或不显示抑制活性。结论:第一部分实验结果显示东北红豆杉和加拿大红豆杉的小枝和针叶中分离纯化的16种紫杉烷类化合物中,2a,9a,10b-triacetyl-5-cinnamoyltaxicin I(6)、2a,10b-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II(8)和4a,10b,13a-acetoxy-2a-benzoyloxy-7b,9a-epidioxy-5b,20-epoxytax-11-en-(16)b-ol(16)具有显著地抑制人肺癌细胞增殖活性,并且其抗癌活性可能与其结构中具有较大张力的C4,5,20环氧丙烷,以及与C-5位碳原子连接的肉桂酰侧链亦有很强的相关性。第二部分紫杉烷类化合物抑制人肺肿瘤细胞增殖作用机制的研究目的:已有报导发现中草药制剂中很多成分都具有抗肿瘤活性,他们多是以诱导肿瘤细胞凋亡的方式来发挥作用的。第一部分的活性筛选实验中,三种紫杉烷类化合物对肺癌细胞的增殖显示明显的抑制活性。本部分实验对化合物16进行作用机制方面的探讨。方法:采用流式细胞分析技术AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测1μmol/L的化合物16作用QG-56细胞12 h及24 h后细胞的凋亡;荧光素酶报告基因检测系统检测化合物16作用于QG-56细胞24 h后,肿瘤细胞相关基因的表达;采用Western Blot法检测化合物16作用QG-56细胞24 h后凋亡蛋白p53、Bax、bcl-2以及Caspase-3的表达。结果:(1)化合物16可诱导QG-56细胞凋亡:1μmol/L化合物16处理QG-56细胞12 h、24 h后,细胞凋亡率分别达到(33.63±2.56)%和(8.48±1.83)%,与对照组(10.97±1.89)%和(7.41±0.72)%相比,具有显著性差异(P0.05);(2)1mmol/L三种紫杉烷类化合物6、8和16作用QG-56细胞24 h后,化合物16可明显诱导QG-56细胞内p53依赖的凋亡信号通路相关报告基因pG13-Luc、p21-Luc、Bax-Luc和hNoxa-Luc的表达增高,而对其他信号通路相关报告基因IgK-Luc、NFAT-Luc、SRE-Luc和CRE-Luc均不显示诱导活性,而化合物6、8对实验选择的报告基因均不显示诱导作用;(3)1mmol/L化合物16处理QG-56细胞24 h后,p53、Bax和Caspase-3蛋白的表达量均明显增加,化合物16对p53上调为空白对照的1.58倍;化合物16对Caspase-3上调为空白对照的1.98倍。化合物16处理QG-56细胞后引起Bax量增高,Bcl-2量减少,Bax表达量为Bcl-2的4.17倍;(4)使用终浓度为20mmol/L的半胱天冬酶抑制剂与不同浓度的化合物16共同孵育人肺癌细胞QG-56后,细胞生存率分别从81.65%、27.47%、2.96%上升到84.79%、39.67%、7.05%。结论:紫杉烷类化合物4a,10b,13a-acetoxy-2a-benzoyloxy-7b,9a-epidioxy-5b,20-epoxytax-11-en-(16)b-ol(16)可诱导人肺癌细胞QG-56凋亡,该作用可能通过上调p53表达,增加Bax表达,进而通过线粒体凋亡途径上调Caspase-3蛋白的表达有关;半胱天冬酶抑制剂能够逆转化合物16对QG-6细胞增殖的抑制作用,进一步说明化合物16诱导凋亡可能是通过Caspase-3信号通路来实现的。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R285;R284

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【参考文献】
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