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《河北医科大学》 2018年
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基于下一代测序技术的同卵双生子线粒体基因组差异研究

谭璐  
【摘要】:目的:法医实际检案中,若现场生物样本来自于同卵双生子(monozygotic twins,MZT),因二者具有几乎完全相同的遗传序列,现有的检测手段尚无法有效区分究竟来自MZT中的哪个个体,导致案件难以或无法侦破,为犯罪嫌疑人的认定带来不确定因素。本课题组对此问题进行系列研究,探索了DNA甲基化遗传标记用于区分MZT的可行性,发现大部分MZT之间存在或多或少的DNA甲基化差异,从中筛选出9条序列共39个CpG位点用于鉴别MZT,鉴别效能达94.2%。但DNA甲基化遗传标记的相对不稳定性以及对检材质量的要求较高,可能限制其在实际检案中的应用。而在核基因组中寻找MZT之间的序列差异,则如同大海捞针,测序及数据分析成本也非常高。线粒体DNA由于经常暴露于各种氧化反应中,且无修复系统、不受选择压力的影响,突变率是核基因组的10倍,因此从理论上讲,MZT自胚胎分离之后,各自在生长发育过程中积累不同的mtDNA突变的几率相对较大,在线粒体基因组中找到鉴别MZT差异位点的几率也就相对较高。而且mt DNA基因组测序及数据分析的成本大大降低,环状结构使其具有很强的抗降解能力,较高的拷贝数也使其检测的灵敏度高于核基因组DNA,非常适用于法医学检验。下一代测序(next generation sequencing,NGS)技术的发展为线粒体全基因组测序提供了有力工具,本研究拟采用NGS技术检测MZT线粒体全基因组序列,观察MZT之间mtDNA序列是否存在差异,并评估其在法医学中的潜在应用价值,为解决MZT法医学甄别难题提供科学依据。方法:1样本采集及DNA定量:从课题组建立的双生子样本库中选取21对MZT血液全基因组DNA样本(-80℃保存)。从两名志愿者毛囊及毛干中应用QIAamp DNA Investigator Kit试剂盒提取DNA。所有DNA样本采用Qubit?dsDNA HS Assay Kit进行定量,样本149b应用Quantifiler?Human DNA Quantification Kit定量试剂盒进行绝对定量。2 Precision ID mtDNA Panel的实验室评价:以样本100a、100b以及9947A标准品构建文库重复测序,进行重复性研究;以样本149b绝对定量结果制备系列起始DNA模板量(100 pg、50 pg、25 pg)进行测序,每个样本平行实验2次进行灵敏度研究;以两名志愿者毛囊和毛干DNA分别构建文库测序,进行试剂盒特异性研究;对样本137a、137b分别采用PGM和MiSeq两个平台测序进行一致性研究。3文库构建:应用Precision ID mtDNA Panel和Precision ID Library Kit按照说明构建文库。除灵敏度研究中采用制备的起始DNA模板量外,其余样本均稀释至0.1 ng/uL,采用0.1 ng起始DNA模板量构建文库。4模板制备:采用Ion PGM?Hi-Q?OT2 Kit在Ion OneTouch?2System仪器上按照说明制备模板。5测序:采用Ion PGM?Hi-Q?Sequencing Kit在Ion PGM?System按照说明进行测序。6结果分析:mtGenome测序结果由Ion Torrent Software Suite插件coverageAnalysis和TVC对比修订的剑桥参考序列rCRS(GenBank ID:NC-012920.1),并结合IGV进行分析。对测序样本的重复性、灵敏度、特异性和一致性进行统计分析,综合评价其在本实验室的效能。通过对比TVC结果中点异质性(point heteroplasmy,PHP)和长度异质性(length heteroplasmy,LHP)寻找区别MZT的位点。应用EMPOP对每个样本mtDNA进行单倍群的判定。7应用Sanger测序进行验证。结果:1 Precision ID mtDNA Panel实验室评估1.1覆盖度本研究检测了49个样本(来自于46个个体和9947A标准品)线粒体全基因组序列,平均测序深度是2433×(±205×)(mean±SE)。1.2重复性研究采用两个样本(100a和100b)分别构建3个文库在同一张芯片上进行测序,用9947A DNA标准品构建2个文库在2张芯片上进行测序,重复结果无显著性差异。1.3灵敏度研究起始DNA模板量低至25 pg时mt DNA仍可被完整检测到,且覆盖度良好。1.4特异性研究本研究通过对比两个个体毛干和毛囊的mtDNA序列TVC结果,发现两者的突变位点及频率是一致的,初步说明本研究TVC结果特异性良好,排除核基因组线粒体假基因(nuclear mitochondrial pseudogenes,NUMTs)的影响。1.5一致性研究通过对比PGM平台和Miseq平台的测序结果,排除低质量位点,除位点5951存在差异,其他位点均一致,因此认为该实验方法在本实验室具有良好的一致性。2 mtDNA序列及异质性分析2.1 mt DNA序列分析与rCRS比对,46个个体(含21对MZT)及9947A标准品共检测到1917个突变,分布在311个位点上,控制区有545个突变,占28.43%,其他区域占71.57%,CR区的变异位点分布较为密集。变异类型中碱基替换占87.38%,插入缺失占12.62%。其中263G、750G、4769G、8860G和15326G在所有47个样本中都存在,73G、2706T、7028T和11719A在除9947A之外的46个受试样本中都存在。9947A来自白种人,故这4个位点的序列差异反映了中国人群与白种人群的差异。2.2 mt DNA异质性分析根据系统设置的TVC结果异质性检出阈值为10%,在21对MZT的42个样本中共检测到14个PHP,42个LHP,8个样本发现了PHP,24个样本发现了LHP。其中大多数MZT之间共享相同的异质性,在2对MZT中均存在PHP 8495A/C,在4对MZT的7个个体中存在LHP 3492.1A,在2对MZT中均存在LHP 13797.1A,在4对MZT中均同时存在突变10873C和LHP 10873DEL。3同卵双生子mt DNA差异分析在所检测的21对MZT中,未发现序列变异水平的差异,只观察到异质性水平的差异。参考文献中NGS检测mtDNA序列异质性分析阈值的设定10%和15%,进行MZT之间异质性差异分析。在所检测的21对MZT中,异质性频率差值≥10%的共计9对,其中PHP频率差值≥10%的有2对,LHP频率差值≥10%的有8对,若以mtDNA异质性频率差值≥10%为标准,两种异质性共可区分9对MZT,占比42.86%。异质性频率差值≥15%的共计2对,其中PHP频率差值≥15%的有1对,LHP频率差值≥15%的有2对,即以mtDNA异质性频率差值≥15%为标准,两种异质性共可区分2对MZT,占比9.52%。4单倍群47个样本的单倍群通过EMPOP进行确认和判定,共得到23个不同的单倍群分配到M、B、D、F、C和H型,分别为27.66%、25.53%、25.53%、14.89%、4.26%和2.13%。每对MZT共享相同的单倍型。5异质性与年龄的相关性本研究统计了46个个体mtDNA异质性位点个数与年龄的相关性,结果显示样本异质性位点个数与年龄无相关性。结论:本研究应用Precision ID mtDNA Panel在Ion Torrent PGM?平台对21对MZT进行线粒体全基因组测序,发现MZT之间在序列变异水平无差异,但在异质性水平存在差异,有9对MZT之间发现异质性频率差异≥10%的位点,其中2对MZT的异质性频率差异≥15%,可以鉴别部分MZT个体。该方法表现了良好的特异性,不受NUMTs的干扰;具有良好的重复性和稳定性,检测灵敏度非常高。表明NGS技术检测mt Genome为鉴别MZT提供了一种新的技术方案,下一步将进行系统的法医学应用评估研究,验证其法医学实际应用价值。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:D919

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