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煤工尘肺支气管肺泡灌洗液细胞和蛋白质成分的分析

蔚岩  
【摘要】:目的尘肺(pneumoconiosis)是在生产过程中长期吸入粉尘而发生的以肺组织纤维化为主的全身性疾病。它的病因明确,但目前尚无有效的治疗方法。其中煤工尘肺(CWP)是我国目前最常见的危害较为严重的一种职业性肺部疾病,是煤矿工人因长期吸入游离二氧化硅含量较低的煤尘引起的疾病,以肺部弥漫性纤维化为主的全身性疾病。在煤矿开采过程中由于工种不同,工人可分别接触煤尘煤矽尘和矽尘,从而引起肺的弥漫性纤维化,统称为煤工尘肺。煤工尘肺的发病情况,因开采方式不同有很大的差异,露天煤矿工人的尘肺患病率很低,井下开采工作面的粉尘度和粉尘分散度均高于露天煤矿,尘肺患病率和发病率均较高。我国地域广大地层结构复杂,各地煤工尘肺患病率有很大差异,在0.92%-24.1%之间,其中矽肺占11.4%,煤矽肺占87.6%,煤肺占1.0%,是严重危害工人健康的一种职业病。占我国职业病总数的80%,其诊断主要依据职业史和X线胸片。近年来对矿物粉尘引起的尘肺机制研究取得较大的进展,其中肺灌洗技术是主要研究方法之一。肺灌洗是通过生理盐水的机械冲刷作用和肺泡内直接注药等手段,将沉积在肺内的粉尘排出体外,以期达到减缓肺部纤维化进程的尘肺治疗措施。大容量肺灌洗可将尘肺病人细支气管和肺泡内长期滞留甚至填塞的粉尘,游离二氧化硅以及吞尘的肺泡内巨噬细胞排除体外,是治疗尘肺最有效的手段。根据灌洗范围液量的不同,可分为支气管肺泡灌洗术(bronchoal veoar lavage,BAL)和大容量全肺灌洗术(whole lung lavage,WLL)。肺灌洗术治疗尘肺及其并发症,能改善呼吸功能,提高血氧饱和度,减轻病人痛苦,效果良好,对疗效观察具有一定的意义。 由于肺泡灌洗术在治疗尘肺及尘肺机制方面有一定意义,故对尘肺灌洗成分分析的研究也是势在必行,因此本次研究分别对煤工尘肺支气管肺泡灌洗液的总蛋白、克拉拉细胞蛋白、SOD酶活力以及细胞成分的测定,并对蛋白质组进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和2-DE的分离,来探讨煤工尘肺的早期预防、诊断及治疗方法。 方法符合国家尘肺GBZ70-2002尘肺诊断标准的0~+、Ⅰ、Ⅱ期接尘工人及尘肺病人住院病例22例,并且对大容量全肺灌洗术无禁忌症的病人。适应症的选择:各种混合及单纯尘肺、肺泡蛋白沉积症、吸入性肺炎、支气管哮喘、肺感染性疾患等。一般状况:年龄:38--58岁,平均为52.1±5.6岁;均为男性患者;接触粉尘类型:煤尘、岩尘、混合粉尘,共接尘年限:26.8±4.3年,其中0~+期接尘工人7例,Ⅰ期尘肺病人11例,Ⅱ期尘肺病人4例。对北戴河中国煤矿工人疗养院进行支气管肺泡灌洗患者的肺灌洗液进行分析,把灌洗液混匀使用低压低温蛋白浓缩仪浓缩蛋白,然后取10ml浓缩灌洗液-70℃保存,待做蛋白质测定。应用双抗体夹心ELISA法对CC-10、超氧化物歧化酶SOD进行测定,最后对灌洗液蛋白质组进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和2-DE的测定,对灌洗液的蛋白质进行分离。对离心后的细胞,应用瑞氏染色法方法进行观察,并应用电镜技术对巨噬细胞进行观察。 结果 1细胞学检验 1.1通过对0~+、Ⅰ、Ⅱ期三个期别各一个尘患者灌洗液进行细胞计数,24瓶尘肺灌洗液的细胞分布呈现偏态分布,高峰为第二瓶和第三瓶。其中0~+期尘肺患者24瓶尘肺灌洗液细胞数最多的尘肺灌洗液瓶号为第二瓶,大约是1.55×1011/L ,细胞总数大约1.00×1012/L。Ⅰ期尘肺患者24瓶尘肺灌洗液细胞数最多的尘肺灌洗液瓶号为第三瓶,大约是1.56×1011/L,细胞总数为1.16×1012/L。Ⅱ期尘肺患者24瓶尘肺灌洗液细胞数最多的尘肺灌洗液瓶号为第三瓶,约1.65×1011/L, 24瓶细胞总数大约是1.18×1012/L。同时对三个期别煤工尘肺灌洗液所含的细胞总数进行比较可以得出:0~+ⅠⅡ期。 1.2取Ⅱ期尘肺患者细胞含量较多的一个离心管灌洗液进行涂片,并应用瑞氏染色法染色,观察巨噬细胞。瑞氏染色后巨噬细胞内部有较多的黑色颗粒,细胞轮廓较清,而且淋巴细胞、中性细胞、嗜酸性细胞等细胞也显示明显。 1.3电镜下可见,巨噬细胞及其胞核较完整,细胞核边缘模糊,偶可见固缩现象,溶酶体增多,巨噬细胞内部有许多被吞噬的粉尘颗粒,被吞入的粉尘颗粒边缘模糊,细胞核较清。 2灌洗液蛋白质的检测 2.1检测BALF中总蛋白的含量。其中0~+期总蛋白含量0.28±0.07 mg/ml,Ⅰ期总蛋白含量0.51±0.09 mg/ml,Ⅱ期总蛋白含量0.82±0.07 mg/ml,结果0~+、Ⅰ、Ⅱ期总蛋白含量明显升高,三组之间存在统计学差异(F=60.29,P0.001)。 2.2检测BALF中SOD的含量。其中0~+期SOD含量306.04±6.12μg/ml;Ⅰ期SOD含量313.20±7.52μg/ml;Ⅱ期SOD含量356.83±7.56μg/ml。三个期别中SOD的含量升高,0~+期与Ⅰ、Ⅱ期有统计学差异(F=71.83 P0.001)。 2.3检测BALF中CC-10的含量。其中0~+期CC-10含量8.23±0.62 ng/ml;Ⅰ期CC-10含量9.53±0.81 ng/ml;Ⅱ期CC-10含量6.48±0.45 ng/ml。结果0~+、Ⅰ、Ⅱ期煤工尘肺灌洗液的CC-10含量有明显降低,三组之间均有差异有统计学意义(F=28.54,P﹤0.001),但Ⅰ期尘肺灌洗液的CC-10含量比0~+、Ⅱ期的含量有所增加。 2.4尘肺灌洗液聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳从聚丙烯酰胺凝胶电泳图中我们可以看出蛋白质分离的较好,能够得出清晰的条带,说明煤工尘肺灌洗液中蛋白质的种类比较恒定。因此我们采用双向电泳技术对灌洗液蛋白质组进行再次分离,以17cm长pH为3-10的线性IPG胶条进行第一相等电聚焦,再以12%SDS-PAGE作为第二相分离,获得了较清晰的接尘工人0~+期及Ⅱ期煤工尘肺病人BALF蛋白质的双向电泳图谱。从左到右,蛋白质等电点增加,从上至下,分子量逐渐减少。 结论 1对灌洗液细胞进行分类,可以见到巨噬细胞、淋巴细胞、中性细胞、嗜酸性细胞从数量上出现明显的升高(P0.05)。在电镜下观察的巨噬细胞形态可以看到细胞核较清,核膜模糊,正常的细胞核膜为两暗一明,但吞噬粉尘后,正常现象消失,偶可见核固缩,细胞核仁依稀可见。 2煤工尘肺支气管肺泡灌洗液中总蛋白含量随着期别的增加显著升高,SOD的活力随着期别的增加而升高。因此通过对其作用机制的分析,可以为阐明尘肺的发病机制起到一定的参考作用。 3本实验发现煤工尘肺支气管肺泡灌洗液中CC10含量是随着煤尘颗粒进入机体的量来变化的,其变化总趋势为降低(0~+期Ⅰ期、Ⅰ期Ⅱ期、0~+期Ⅱ期)。因此检测CC10可反映早期Clara细胞的损伤情况,为早期判断肺损伤出现及其恢复提供依据。 4通过对煤工尘肺支气管肺泡灌洗液蛋白质组的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向电泳的分析,对BALF中的可溶性蛋白成分进行了分离,获得了清晰的0~+期接尘工人及Ⅰ期尘肺病人BALF中蛋白质的双向电泳图谱,通过图像对比揭示了BALF中蛋白成分质和量的改变。


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