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姜黄素体外肝代谢产物检测及姜黄素与其代谢产物透体外血脑脊液屏障模型研究

张海威  
【摘要】:姜黄素(Curcuminoids,Cur)是从姜科植物姜黄、莪术和郁金等根茎中提取的有效成分,具有β-二酮与两个邻甲基化的酚相连组成的共轭分子结构的多酚类化合物。姜黄素的药理学作用十分宽泛,包括降血脂、抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及对心血管系统、神经系统的保护作用。近年来研究发现,姜黄素在神经保护效应中有较高的应用价值,比如,在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkison’s disease,PD)等神经退行性疾病中的神经保护作用。姜黄素难溶于水,口服后吸收率低,代谢排泄速率快,造成其生物利用度较低,但姜黄素广泛的药理作用并非因其低的生物利用度而减弱,由此可推断,姜黄素的药理活性的产生未必直接由其原型药的作用产生,可能与分布在组织中的姜黄素代谢产物或降解产物的作用有关。肝脏组织中包含各种代谢酶系,为生物体内主要的药物代谢器官,是药物代谢研究的重要手段。本研究主要通过姜黄素溶液与肝匀浆混悬液共同置于37℃水浴孵育,用高效液相法测定姜黄素在体外肝代谢的产物。研究表明,姜黄素的次级代谢产物之一四氢姜黄素,同样具有神经保护作用,是姜黄素代谢成为四氢姜黄素后进入脑组织,还是姜黄素透过血脑脊屏障在脑组织中代谢产生四氢姜黄素,缺乏相关的研究报道。血脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier,blood-CSF barri-er)是生物体内一个重要的动态生理调节屏障,其主要由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)、星形胶质细胞(a strocyte,As)足突、周细胞和基底膜等协同构成的一个复合结构。研究药物在血脑脊液屏障传递特性的方法主要分为体内和体外试验,体外试验避免了体内试验的整体复杂性,相对适合于机制研究。本研究采用同种属原代大鼠BMECs和As共培养的方法,建立体外血脑脊液屏障模型,并在此基础上进行姜黄素及其肝代谢产物透过试验。1.体外血脑脊液屏障模型的建立及鉴定新生Sprague-Dawley(SD)大鼠(24h以内)大脑皮层组织为材料,通过酶消化,离心得到As,在As培养基中分离纯化培养,可见典型的As形态学特征,GFAP呈阳性表达,细胞纯度在95%以上;新生SD大鼠(7d以内)脑皮层灰质组织为材料,通过两步酶消化和牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)离心,得到分离纯化的脑微血管段,再接种到BMECs特殊培养基中,BMECs从脑微血管段中生长出来通过分离纯化培养,可见BMECs典型的“铺路石”特征,Ⅷ表达呈阳性,细胞纯度在95%以上。BMECs与As不同时间、续惯性接种于Transwell半透膜上下表面,细胞间透过半透膜进行联系,以Transwell小室和细胞培养板为基础建立体外血脑脊液屏障,可见BMECs和As清晰形态,贴壁融合生长。通过测定跨内皮细胞电阻值(Trans-endothelial cell resistance,TEER)共培养模型组显示高电阻值(378.97±11.38)Ω·㎝2,4小时液面试漏试验阳性,初步判断血脑脊液屏障已形成,再对血脑脊液屏障的特征性指标γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptid-ase,γ-GT)和碱性磷酸酶(Alkaline phosph-a tase,ALP)以及荧光素钠通透试验,均表现出高酶活性和较强旁路限制通过能力(P0.01)。通过实验证实已建立相对简单可靠、重复性好、接近在体状态的体外血脑脊液屏障模型,可应用于后续的药物转运试验。2.姜黄素体外肝代谢产物产物检测将姜黄素溶液与兔肝匀浆混悬液在37℃水浴孵育,通过HPLC法检测姜黄素含量,并比较姜黄素体外代谢代谢前后色谱图的变化,来检测代谢产物的产生。在肝代谢后,保留时间为3.7min出现的一个色谱峰,其峰面积在一定的代谢时间内随着姜黄素色谱峰峰面积的减少而不断增加,并且随着姜黄素浓度和肝匀浆混悬液浓度增加而增多,初步确定其为姜黄素肝代谢产物。通过单因素试验确定最佳肝代谢实验条件,结果表明,在姜黄素浓度为163μmol·L-1,肝匀浆混悬液浓度为0.6g·m L-1,孵育时间为120min的条件下代谢产物的生成量最佳。3.姜黄素及其代谢产物体外血脑脊液屏障模型的转运通过姜黄素和姜黄素代谢产物安全浓度筛选实验,确定姜黄素浓度为652μmol·L-1和姜黄素代谢混合物的浓度为326μmol·L-1。将两种溶液加到体外血脑脊液屏障上,在1h的转运实验后,结果发现,姜黄素的原型药有微量的通过,但代谢后的姜黄素仅检测到微量的代谢产物存在。实验表明,姜黄素为血脑脊液屏障低渗透性药物,其代谢产物的血脑脊液屏障透过性需要进一步实验证明。


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