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《承德医学院》 2010年
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野黄芩苷对人牙周膜细胞保护作用的实验研究

杨宁  
【摘要】:目的: 人牙周膜细胞作为牙周组织的基础细胞,在牙周组织的再生和修复中发挥着重要作用。本课题旨在探讨黄芩茎叶提取物-野黄芩苷对牙周膜细胞的保护作用,为野黄芩苷应用于临床治疗牙周病提供理论和实验依据。 方法: 1无菌取青少年因正畸拔除的健康牙,体外原代培养牙周膜细胞,免疫细胞化学方法鉴定细胞来源。 2实验分组及干预:分为正常对照组、LPS干预组、不同浓度野黄芩苷+LPS干预组。正常对照组用2% FBS的DMEM培养液培养牙周膜细胞;LPS组用100μg/ml的LPS处理细胞;野黄芩苷+LPS组分别用0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的野黄芩苷和100μg/ml的LPS处理细胞。 3采用四唑盐比色(MTT)方法,观察野黄芩苷对LPS作用的人牙周膜细胞增殖活性的影响。 4采用流式细胞技术观察野黄芩苷对LPS作用的人牙周膜细胞的细胞周期的影响。 5采用酶动力学方法观察野黄芩苷对LPS抑制人牙周膜细胞的碱性磷酸酶活性的作用。 6采用酶联免疫方法(ELISA)检测人牙周膜细胞培养上清液中的TNF-α水平。 7采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测人牙周膜细胞MMP-1、MMP-2的表达情况。 8数据处理采用SPSS11.5统计学软件进行,采用单因素方差分析和LSD-t检验, P 0.05表示差异有统计学意义。 结果: 1体外培养牙周膜细胞成功后,对第三代细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,显示细胞波形丝蛋白阳性、角蛋白染色阴性,确定为牙周膜细胞。 2野黄芩苷对牙周膜细胞增殖活性的影响 LPS干预组牙周膜细胞24h、48h、72h与相应同期正常对照组相比,牙周膜细胞增殖活性均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01),说明100μg/ml LPS能明显抑制牙周膜细胞的增殖活性。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度的野黄芩苷干预后,与LPS组相比,0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml浓度的野黄芩苷作用牙周膜细胞24h;0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml浓度的野黄芩苷作用牙周膜细胞48h; 0.1μg/ml、1μg/ml浓度的野黄芩苷作用牙周膜细胞72h时,牙周膜细胞增殖活性增加,差异具有统计学意义(P 0.05,P 0.01),提示野黄芩苷具有拮抗LPS抑制牙周膜细胞增殖活性的作用。 3野黄芩苷对牙周膜细胞的细胞周期影响 牙周膜细胞经100μg/ml LPS处理24h,G0/G1期、S期、G2M期细胞所占百分比分别与正常对照组的对应时相相比有所不同,但差异无统计学意义(P 0.05)。同时段加入1μg/ml浓度野黄芩苷后,G0/G1期所占百分比降低,而G2M期所占百分比和增殖指数(Prl值)明显升高,与LPS组比较,差异具有统计学意义(P 0.05)。 4野黄芩苷对牙周膜细胞碱性磷酸酶活性的影响 100μg/ml LPS处理牙周膜细胞72h,与正常对照组相比,ALP活性显著受到抑制(P 0.01)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷后,在较低浓度0.001μg/ml、0.01μg/ml时作用不明显,0.1μg/ml对LPS抑制ALP活性已有明显的拮抗作用(P 0.05),在1μg/ml时拮抗作用达到高峰(P 0.01)。 5野黄芩苷对牙周膜细胞分泌TNF-α的影响 正常对照组的牙周膜细胞分泌较低水平的TNF-α。经100μg/ml LPS处理24h,牙周膜细胞分泌TNF-α水平提高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P0.01)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷,各浓度的野黄芩苷对LPS刺激TNF-α分泌均有显著的抑制作用(P 0.01),其中在野黄芩苷浓度1μg/ml时抑制作用达到最大,并且与较低浓度0.001μg/ml、0.01μg/ml野黄芩苷组比较,差异有统计学意义(P 0.01)。 6野黄芩苷对牙周膜细胞MMP-1、MMP-2蛋白表达的影响 6.1 MMP-1蛋白表达的结果 Western-Blot检测显示:HPDLCs经100μg/ml的LPS处理24h后,MMP-1蛋白表达量比正常对照组有所增多,但差异无统计学意义(P0.05)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷后,随着药物浓度的增加,MMP-1蛋白表达量有减少趋势,但与LPS组比较,差异无统计学意义(P 0.05)。 6.2 MMP-2蛋白表达的结果 Western-Blot检测显示:正常对照组HPDLCs表达较低水平的MMP-2蛋白,100μg/ml的LPS处理HPDLCs 24h,MMP-2蛋白表达量增多,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P 0.05)。同时段加入0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml不同浓度野黄芩苷,MMP-2蛋白表达有所减少,但仅在10μg/ml野黄芩苷组,与LPS组比较差异有统计学意义(P 0.05)。 结论: 1 100μg/ml LPS抑制牙周膜细胞的增殖和碱性磷酸酶活性,诱导牙周膜细胞的TNF-α的分泌和MMP-2蛋白表达。 2加入不同浓度的野黄芩苷能拮抗LPS对牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的抑制作用,并且能抑制TNF-α的分泌和MMP-2蛋白表达。 3本研究结果提示,野黄芩苷对人牙周膜细胞有保护作用。
【学位授予单位】:承德医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R781.4

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