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《承德医学院》 2007年
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真核表达载体P~(EGFP-N1)-IL-2构建及CIK细胞的体外扩增

刘秋霞  
【摘要】: 目的:白细胞介素2(Interleukin-2, IL-2)是由T辅助细胞产生的细胞因子,具有广泛的生物学活性,在免疫应答的调节过程中起着重要作用。特别是1983年基因重组IL-2的问世,使得IL-2的研究取得了很大的进展。目前IL-2已被应用于治疗免疫缺陷,感染性疾病和肿瘤并取得了显著疗效。它对肿瘤细胞无直接细胞毒作用,主要通过净化骨髓、参与诱导肿瘤细胞凋亡、作为肿瘤疫苗、调节肿瘤细胞侵袭力和转移力以及增强免疫效应细胞对肿瘤细胞的毒性等机制调节机体免疫系统发挥抗肿瘤效应。人们已将外源性IL-2在肿瘤局部注射发现可以抑制肿瘤生长。因IL-2可刺激参与抗肿瘤免疫效应细胞如细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine-activated killer cell, LAK)、自然杀伤细胞(Natural killer cell, NK)和巨噬细胞的增殖作用,临床将IL-2和LAK或CTL细胞合用对某些肿瘤有一定疗效。然而对肿瘤患者全身大剂量使用IL-2会引起严重毒副作用,且还存在IL-2半衰期短和肿瘤局部用量不足的缺点。通过将IL-2基因导入肿瘤细胞使肿瘤细胞持续性分泌IL-2于肿瘤局部,可诱导宿主免疫效应细胞在肿瘤局部聚集、增殖而增强宿主的抗肿瘤免疫效应。过去的研究已将IL-2cDNA导入一些免疫效应细胞如CTL、LAK、肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lympho-cyte, TIL)等细胞中,并在体内呈现出较强的抗肿瘤免疫效能。但由于这些免疫效应细胞活性低,增殖活性差,细胞来源困难等原因,人们也在不断的寻求更高效的免疫效应细胞。CIK(Cytokine-induced killer )细胞是1991年由美国斯坦福大学在过去的免疫效应细胞的基础上制备了一种新型免疫活性杀伤性细胞,是一种用外周血单个核细胞(PBMC)在体外经过多种细胞因子培养激活后获得的非MHC限制性的对肿瘤细胞具有高效溶解毒性的T细胞。杀瘤谱广、效率高。本实验的目的就是克隆IL-2基因并培养CIK细胞,为下一步IL-2 cDNA导入CIK细胞及其临床应用打下基础。 方法:1.设计合成C57BL/6小鼠IL-2基因的引物,并根据所用限制性内切酶BamH I和Kpn I在引物的5'端加上酶切序列及保护碱基。2.总RNA提取。颈脱位处死C57BL/6小鼠,无菌摘除脾脏,用TRIzol提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,紫外分光光度计测其OD值和浓度。3.RT-PCR(逆转录PCR)。以总RNA为模板,Oligo(dT)为引物,加入逆转录酶进行逆转录,然后再以逆转录产物为模板,IL-2特异性引物为引物,加入Pfu酶进行PCR,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,如见到预期510bp大小的条带,则表明总RNA提取成功,逆转录产物完整,可用于下一步实验。4.融合质粒PEGFP-N1-IL-2的构建。用限制性内切酶BamH I和Kpn I消化质粒PEGFP-N1和PCR产物,将切下的PCR产物克隆至真核表达载体PEGFP-N1,构建融合质粒PEGFP-N1-IL-2,将融合质粒转化感受态大肠杆菌(Ecoli)DH5α后,接种于预先用50ug/ml卡那霉素涂布的LB固体培养基平板上进行筛选。挑取单个菌落接种在含有卡那霉素的LB液体培养基中,250r/m摇床增菌培养12h-16h,用质粒提取试剂盒提取质粒。然后以提取的质粒为模板,加入上述IL-2特异性引物进行PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,如见到预期510bp大小的条带,则证明融合质粒PEGFP-N1-IL-2构建成功,对构建的质粒测序。5.IL-2基因转染HepG2肝癌细胞将融合质粒PEGFP-N1-IL-2用脂质体2000转入HepG2肝癌细胞中,经48h培养后,提取总RNA,进行RT-PCR以确定IL-2基因在HepG2肝癌细胞中得到表达。6.CIK细胞的培养颈脱位处死一只C57 BL/6小鼠,无菌摘除脾脏,制成脾单细胞悬液,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,生理盐水洗涤淋巴细胞,加入含10%胎牛血清的1640培养液培养并加入干扰素γ(interferon gamma ,IFN-γ)、CD3单抗(anti-CD3 monoclonal antibody)、白细胞介素1(Interleukin-1α,IL-1a)、IL-2多种细胞因子,于第0d、第4d、第7d经流式细胞仪(FACS)测定CD3-4-8和NK1.1,其中每三天换液一次。 结果:1.从C57BL/6小鼠脾组织中提取的总RNA,OD260/OD280为1.845,表明获得的总RNA未被蛋白质污染,有很高的纯度可用于逆转录,总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳显示清晰的28s、18s、5s条带且28s带宽为18s的二倍,表明总RNA的完整性。2.以总RNA为模板,经RT-PCR后得到的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在510bp位置上可见到一条清晰的特异条带,与预期片段的大小结果一致。3.构建融合质粒PEGFP-N1-IL-2转化感受态大肠杆菌(Ecoli)DH5a后,用质粒提取试剂盒提取质粒。然后以提取的质粒为模板,加入上述IL-2特异性引物进行PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见到一清晰的约510bp大小的条带,证明融合质粒PEGFP-N1-IL-2构建成功。PEGFP-N1是可以直接测序的载体,对构建的质粒测序,经测序公司测序,得到了克隆片段的cDNA序列,经比较与小鼠IL-2cDNA序列完全一致。4.将融合质粒PEGFP-N1-IL-2用脂质体2000转入HepG2肝癌细胞中,经48h培养后,提取总RNA,进行RT-PCR,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见到一清晰的约510bp大小的条带,可确定IL-2基因在HepG2肝癌细胞中得到表达。5.CIK细胞的培养中第0d FACS测得CD3:28.78%、CD4:11.44%、CD8:7.04%、NK1.1:24.97%,第4d FACS测得CD3:94.78%、CD4:25.08%、CD8:33.91%、NK1.1:15.36%,第7d FACS测得CD3:93.47%、CD4:20.96%、CD8:23.74%、NK1.1:10.08%,第8天收获CIK细胞。
【学位授予单位】:承德医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R73-36

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