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《河北师范大学》 2003年
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小麦外源抗黄矮病基因相关片段的克隆和鉴定

许景升  
【摘要】： 根据已克隆植物抗病基因编码蛋白质的保守结构设计引物，利用基于同源序列的候选基因法，扩增中间偃麦草、抗黄矮病易位系及感病材料，得到一条与抗性共分离的特异带，约538bp、将此特异标记带转化为SCAR(sequence characterized amplified region)标记，命名为TirgaZ1，用于筛选HW642基因组TAC文库，得到4个阳性克隆T1，T2，T3，T4，对阳性克隆进行了限制性内切酶分析，发现四个阳性克隆分为两类：T1，T2，T3为一类，T4为另一类。将阳性克隆T1和T4的酶切产物转膜，以RGA基因片段TirgaZ1做探针进行Southern杂交，各酶切产物均有明显的不同杂交带，并且同一酶切产物杂交带中包含1-2条相同带和1-3条相异带，即这2个克隆可能部分重叠、位于1个contig的两侧。对T1进行序列分析，表明T1含有抗病基因保守结构域，说明这2个克隆为含有NBS类R基因片段TirgaZ1的候选抗病基因克隆。 以抗病中间偃麦草、HW642和感病小麦亲本的基因组DNA做探针，对阳性克隆T1和T4的酶切产物进行Southern杂交分析，由杂交图谱可知，XhoI，EcoRV，EcoRI，PstI酶切产物与中间偃麦草、HW642的基因组DNA产生了小麦不存在的特异杂交带，进一步说明阳性克隆T1和T4是来源于中间偃麦草7XL的侯选抗黄矮病基因克隆。 根据已克隆植物抗病基因编码蛋白质的保守结构设计引物，利用抗病基因类似物多态性技术(resistance gene analog polymorphism，RGAP)，研究与Bdv_2相关的RGAP标记和RGA基因片段。用187对引物组合，对具Bdv_2的不同抗病材料和不具Bdv_2感病材料进行分析，结果表明有2对引物组合cf9F／PtoKin2UIN(Tgp-1)、PtoF／XLRRinv2(Tgp-2)能稳定地扩增出与Bdv_2相关的抗病特异带，大小分别为350bp和210bp左右，说明这2个标记Tgp-1_(350)和Tgp-2_(210)是Bdv2相关的RGAP标记。用F_2群体进行的连锁分析结果表明这2 河北师范大学硕士研究生学位论文 个RGAP标记与丑动心共分离。从聚丙烯酞胺凝胶上回收特异扩增产物，二次 扩增后克隆、侧序.序列分析表明，T纷13，和T争入l。是某些基因ORF的一 部分，是新的基因片段。根据它们序列，重新设计引物，成功地将RGAP标记 T争13，转换为特异PCR标记sC一gPI，FZ群体分析结果表明sc一gPI也与及扣2 共分离。
【关键词】：小麦 黄矮病抗性:可转化人工染色体 抗病基因类似物多态性
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：S512.1
【目录】：
  • 缩写词及专有名词6-7
  • 摘要7-9
  • ABSTRACT9-11
  • 第一部分 引言11-30
  • 1 中间偃麦草有益基因导入普通小麦及其检测11-16
  • 1.1 中间偃麦草有益基因导入普通小麦11-13
  • 1.2 小麦遗传背景下中间偃麦草染色体组、片段的检测13-16
  • 1.2.1 形态标记13
  • 1.2.2 细胞标记13-14
  • 1.2.3 生化标记14
  • 1.2.4 原位杂交14
  • 1.2.5 分子标记14-15
  • 1.2.6 RGAP标记15-16
  • 2 植物抗病基因克隆研究进展16-27
  • 2.1 抗病基因(R基因)的抗病机理17-19
  • 2.2 DNA水平的基因克隆方法19-23
  • 2.2.1 转座子标签技术19-20
  • 2.2.2 图位克隆20-21
  • 2.2.3 同源PCR技术21-23
  • 2.3 RNA水平的基因克隆方法23-27
  • 2.3.1 代表性差式分析法23-24
  • 2.3.2 抑制消减杂交法24-25
  • 2.3.3 差异显示法25-26
  • 2.3.4 RNA指纹技术26-27
  • 3 立题意义及技术路线27-30
  • 3.1 立题意义27-29
  • 3.2 技术路线29-30
  • 第二部分 研究报告30-69
  • 1 材料与方法30-40
  • 1.1 材料30-31
  • 1.2 方法31-40
  • 1.2.1 HW642基因组DNA的提取(酚-氯仿方法)31
  • 1.2.2 抗病基因类似物多态性技术(RGAP)扩增程序31-32
  • 1.2.3 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段32-33
  • 1.2.4 特异片段的克隆33
  • 1.2.5 感受态细胞的制备33-34
  • 1.2.6 连接产物的转化34
  • 1.2.7 质粒DNA的提取34-35
  • 1.2.8 质粒DNA的限制内切酶消化反应35
  • 1.2.9 序列分析和特异PCR引物的设计35-36
  • 1.2.10 SCAR扩增36
  • 1.2.11 SOUTHERN转移程序(用于RFLP分析)36-37
  • 1.2.12 探针标记37-38
  • 1.2.13 预杂交和杂交反应38
  • 1.2.14 洗脱38-39
  • 1.2.15 放射自显影39
  • 1.2.16 膜上探针的去除39
  • 1.2.17 克隆池法PCR(POOLED PCR)39-40
  • 1.2.18 特异引物TIRGAZ1的扩增反应条件40
  • 2 结果与分析40-54
  • 2.1 小麦抗黄矮病相关基因RGA片段的获得40-46
  • 2.1.1 利用PCR技术获得小麦抗黄矮病相关基因RGA片段40-42
  • 2.1.2 利用RGAP技术获得小麦抗黄矮病相关基因RGA片段42-44
  • 2.1.3 RGAP标记的克隆和序列分析44-45
  • 2.1.4 RGAP标记转化为特异PCR标记45-46
  • 2.2 抗病易位系HW642基因组TAC文库的筛选46-52
  • 2.3 小麦抗黄矮病基因BDV_2的SCAR检测52-54
  • 3 讨论54-57
  • 4 结论57-58
  • 5 参考文献58-69
  • 致谢69-70
  • 个人简历70

【参考文献】
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