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小麦外源抗黄矮病基因相关片段的克隆和鉴定

许景升  
【摘要】: 根据已克隆植物抗病基因编码蛋白质的保守结构设计引物,利用基于同源序列的候选基因法,扩增中间偃麦草、抗黄矮病易位系及感病材料,得到一条与抗性共分离的特异带,约538bp、将此特异标记带转化为SCAR(sequence characterized amplified region)标记,命名为TirgaZ1,用于筛选HW642基因组TAC文库,得到4个阳性克隆T1,T2,T3,T4,对阳性克隆进行了限制性内切酶分析,发现四个阳性克隆分为两类:T1,T2,T3为一类,T4为另一类。将阳性克隆T1和T4的酶切产物转膜,以RGA基因片段TirgaZ1做探针进行Southern杂交,各酶切产物均有明显的不同杂交带,并且同一酶切产物杂交带中包含1-2条相同带和1-3条相异带,即这2个克隆可能部分重叠、位于1个contig的两侧。对T1进行序列分析,表明T1含有抗病基因保守结构域,说明这2个克隆为含有NBS类R基因片段TirgaZ1的候选抗病基因克隆。 以抗病中间偃麦草、HW642和感病小麦亲本的基因组DNA做探针,对阳性克隆T1和T4的酶切产物进行Southern杂交分析,由杂交图谱可知,XhoI,EcoRV,EcoRI,PstI酶切产物与中间偃麦草、HW642的基因组DNA产生了小麦不存在的特异杂交带,进一步说明阳性克隆T1和T4是来源于中间偃麦草7XL的侯选抗黄矮病基因克隆。 根据已克隆植物抗病基因编码蛋白质的保守结构设计引物,利用抗病基因类似物多态性技术(resistance gene analog polymorphism,RGAP),研究与Bdv_2相关的RGAP标记和RGA基因片段。用187对引物组合,对具Bdv_2的不同抗病材料和不具Bdv_2感病材料进行分析,结果表明有2对引物组合cf9F/PtoKin2UIN(Tgp-1)、PtoF/XLRRinv2(Tgp-2)能稳定地扩增出与Bdv_2相关的抗病特异带,大小分别为350bp和210bp左右,说明这2个标记Tgp-1_(350)和Tgp-2_(210)是Bdv2相关的RGAP标记。用F_2群体进行的连锁分析结果表明这2 河北师范大学硕士研究生学位论文 个RGAP标记与丑动心共分离。从聚丙烯酞胺凝胶上回收特异扩增产物,二次 扩增后克隆、侧序.序列分析表明,T纷13,和T争入l。是某些基因ORF的一 部分,是新的基因片段。根据它们序列,重新设计引物,成功地将RGAP标记 T争13,转换为特异PCR标记sC一gPI,FZ群体分析结果表明sc一gPI也与及扣2 共分离。


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