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小麦耐盐相关基因cDNA的克隆与功能研究

葛荣朝  
【摘要】:世界上存在着大面积的盐碱地,高浓度的盐胁迫造成植物生长严重停滞,甚至导致死亡。盐碱耕地中种植的作物往往发生大幅的减产。近年来,利用转基因操作直接将植物耐盐基因转入相应的作物,已经成为耐盐作物育种最为有效的手段之一。进行作物刚盐基因工程育种,首要的前提就是要获得有效的耐盐基因。本论文的目的就是在前人的工作基础上,进一步对小麦耐盐相关基因的cDNA全长序列进行克隆,并初步对其耐盐功能进行研究,为将来小麦耐盐基因工程的开展做一些有益的探索。 本研究首先利用种子活力指数、相对根长、细胞质膜透性和SOD酶活性指标,对小麦突变体后代中得到的一系列近等位基因系进行了苗期耐盐性检测。检测结果表明与大田盐池的检测结果基本吻合,确定了耐盐品系RH8706-49和敏盐品系H8706-34在苗期的耐盐性也存在着一定的差异,可以作为后续研究的实验材料。 通过对26个利用cDNA-AFLP技术得到的cDNA序列进行反向Northern实验,结果表明只有6个cDNA片段出现阳性杂交信号,其余20个cDNA片段没有明显的杂交信号。根据NCBI-BLAST的信息,我们选择23和88号作为研究目标,对其基因全长利用3′RACE和5′RACE方法进行研究。另外,在利用NCBI-BLASTn对其余33个差异片段进行比对时,又发现81号cDNA片段可以利用电子拼接得到其全部3′序列的信息及其转录方向。 23号cDNA片段经过3′RACE和电子拼接得到其3′部分的1210bp序列,其中开放阅读框834 bp,共编码277个氨基酸。软件预测,该部分肽段的分子量为31426.05D,等电点为4.85,并含有66.8%的α螺旋结构(Alpha),很可能具有钙调素结合域和Cytochrome P450半胱氨酸亚铁血红素结合区域。该肽段第216到236个氨基酸区域属于一个较为可信的跨膜区域,另外通过NCBI比对分析,该部分氨基酸序列与cytochrome P450(pfam00067.11)具有较高的同源性。因此,23号cDNA编码的肽段初步可以认为具有依赖于钙调素调节的Cytochrome P450活性。 81号cDNA经过5′RACE扩增得到890bp的cDNA全长序列,其中开放阅读框663bp,共编码220个氨基酸。经软件推测,81号基因编码的蛋白质分子量为24918.06D,等电点为8.3,含有44.1%的β螺旋结构和38.2%的α螺旋结构。通过软件检测发现该蛋白序列存在两个跨膜区域,其中第79到99个氨基酸区域属于较为可信的跨膜区域。软


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