多枝赖草基因组TAC文库的构建

【摘要】：TAC载体的设计脱胎于YAC和PAC,被赋予了许多新的优点。它不会因发生重组交换而导致嵌合现象,因而可以在大肠杆菌和农杆菌之间穿梭;在农杆菌的介导下能直接将外源基因整合到植物基因组中,因此,一旦获得目标阳性克隆后,不需要做繁琐并有可能导致目标基因丢失的亚克隆工作,不需要重新构建转化载体,就可以直接对突变体转化进行功能互补实验:验证功能后的含有目的基因的克隆,即使基因结构未知,也可直接进行植物转基因育种工作,从而加速目的基因的实用化进程。 多枝赖草目前已被证实具有突出的耐干旱、耐盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗逆特性。因此,构建多枝赖草基因组文库,分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因,非常必要。 本研究参考了前人关于TAC文库及BAC文库的构建方法,建立了自己的一套高效的TAC文库构建的技术体系。包括载体检测:高分子量DNA的获得:大量部分酶切最佳条件的确定;片段大小的选择;高效的连接与转化体系等,最终得到所需大小的插入片段,转化效率高,重组率高,空载率低的TAC文库构建体系。 利用所建立的高效TAC文库构建技术体系,以DYLTAC17为载体,构建了多枝赖草的TAC文库,选择幼嫩的多枝赖草叶片,分离细胞核,在相差显微镜下进行核完整性的检测和计数以调整合适的核浓度为29X10~7个/ml;到目前为止共获得500,000个TAC克隆。TAC克隆以单克隆及克隆池两种形式保存,随机挑取50个TAC克隆用碱裂解法提取质粒,琼脂糖凝胶电泳检测空载率6%,重组克隆率94%。