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《河北师范大学》 2008年
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富集文库法开发谷子的微卫星分子标记

李琳  
【摘要】: 谷子(foxtail millet,Setaria Italica Beauv.)属禾本科(Gramineae)狗尾草属[Setaria (L.)Beauv.],是世界上最古老的农作物,并且作为一种重要的粮食作物,在我国北方粮食生产中占有较重要的地位。谷子许多特殊有益性状是其他禾谷类作物所没有的,如:抗旱性、耐盐性、高效水利用、耐瘠性、多种抗病抗虫性、人体必需营养相对均衡等。但由于谷子只是区域重要性作物,相对于禾本科其他作物,如水稻、玉米、小麦等,其影响小,生物技术研究也相对较少,特别是特异性分子标记、功能基因组研究等领域基本为空白。 微卫星(SSR)是指由1~6个核苷酸为单位、呈串联重复的DNA序列,广泛分布于真核生物的整个基因组中。微卫星标记具有共显性、多态性高、重复性好等特点,是较为理想的分子标记,被广泛地用于群体遗传研究、遗传图谱构建、数量性状基因QTL定位、辅助选择等。由于谷子尚未开发SSR标记,限制了对这些领域的研究,因此急需开发适于谷子研究的SSR标记,构建谷子的遗传连锁图谱,并对谷子及近缘种群进行遗传多样性分析,为谷子功能基因分析、克隆及分子标记辅助育种等工作奠定基础。 本研究的目标是应用微卫星富集文库,开发谷子的SSR标记:以生物素标记的(AC)_(15)、(AT)_(15)、(AG)_(12)、(TG)_(12)和(TC)_(12)为探针进行杂交,借助磁珠固定筛选出含微卫星的Sau3AI酶切片段,洗脱转入载体后构建了富集相应微卫星的5个文库;从5个文库中共得到2333个克隆,使用相应载体克隆位点两端的M13+/-及SP6L/T7L引物和相应的微卫星筛选探针序列(AC)_(10)、AT)_(15)、(AG)_(10)、(TG)_(10)和(TC)_(10)分别为混合引物对这些克隆进行PCR二次筛选,鉴定出含SSR序列的克隆。将经过二次筛选获得的1122个阳性克隆进行测序,获得了1106个序列,其中含微卫星的克隆有846个(76.5%);排除冗余序列后得到417个非同源性克隆,共含有463个微卫星位点;对微卫星种类进行分析,其中(AC/TG)_n、(CA/GT)_n和(AG/TC)_n、(GA/CT)_n比例最高(n≥5),共占98.9%,并发现(AT/TA)_n和四核苷酸重复(GACA)_n、(ACGC)_n、(GCGT)_n以及六核苷酸重复(ATACAC)_n。选取从谷子富集文库中得到的合适微卫星位点设计引物,共设计393对;此外利用谷子YAC文库中16个微卫星序列(美国提供)设计出25对引物,共设计谷子SSR引物418对。 用豫谷1号检测这418对SSR引物的扩增稳定性,发现部分引物无扩增或不稳定,优化反应条件后全部稳定扩增出目的条带;随机选取39对非特异条带少的引物,用12个谷子和8个青狗尾草品种检测它们的多态性信息,结果在筛选出的22对(56.4%)多态性引物中共检测到185个等位基因,每对引物平均为8.41个;其中引物GTDZ7-73和AGDZ23-41检测到的等位基因最多(16个),最少的AGDZ23-10中检测到2个,其PIC值分别为0.91、0.90和0.37,22对引物平均PIC值为0.76,显示出较高的位点变异频率,说明所开发的SSR标记适用于谷子和狗尾草属遗传学研究。 利用多态性SSR引物在28份狗尾草属不同种和品种间扩增,统计各标记的等位基因频率分布,22个多态性引物总共检测到221个等位基因,不同品种间变异范围为2~22个,平均10.05个;平均PIC值为0.78,变异范围在0.37~0.93之间。进一步研究发现,SSR标记在谷子、青狗尾草及其它种狗尾草中的多样性表现不同,三者中发现的等位基因数分别为138、175和194个,分别占总数(221)的62.4%、79.2%和87.8%,而且青狗尾草品种平均PIC值(0.73)高于谷子品种(0.72),证明谷子间的遗传差异低于野生青狗尾草;同时数据对比表明,青狗尾草与谷子间的亲缘关系比其它种狗尾草近。根据这22个标记在谷子及近缘野生种的变异数据,计算各基因型的遗传相似系数,根据SM系数进行聚类分析,采用UPGMA法构建狗尾草属遗传进化关系图,结果表明:所用22个SSR标记即可将28份材料清晰分为2大类群(青狗尾草类群和金色狗尾草类群),3个小组(谷子、青狗尾草、金色狗尾草),而且谷子与青狗尾草之间的遗传距离小于与其它种的遗传距离,进一步证实了谷子起源于青狗尾草的观点;谷子相对紧密的聚在一起,且其间的遗传差异明显小于狗尾草,证明谷子在进化中发生遗传变异的几率相对狗尾草较低,表明其基因组的相对保守性;而通过对2大类群间差异的分析得出,金色狗尾草类群可能早于谷子和狗尾草分化之前就已经与它们分开,从一定程度上揭示了狗尾草属基因组进化情况。 本研究首次构建了谷子的微卫星富集文库,开发出了首批418对谷子的SSR标记特异引物,并对其中的22对引物的扩增特性进行了分析,建立了这些标记的多态性遗传参数,并检验了这些标记在狗尾草属谷子近缘种的跨物种实用性,为谷子功能基因组研究、分子标记辅助育种,以及狗尾草属和近缘种的遗传进化研究提供了标记数据基础。
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