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《山西大学》 2011年
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二氧化硫诱导大鼠海马神经元损伤效应及其分子机制研究

云洋  
【摘要】:随着中国大中型城市能源结构的转变以及大气污染源的变化,煤炭大气污染对环境和人群健康的危害将变得更为隐蔽,更易被忽视。在中国燃煤所造成的大气污染中,二氧化硫(S02)排放贡献率为85%,依旧领先于烟尘、氮氧化物以及二氧化碳等其他大气污染物。山西省是我国以煤炭为主要能源的重化工基地之一,在全省城市、工矿区以及居民集中的地区,大气SO2污染普遍存在,因此长期接触低浓度SO2所引发的健康危害问题显得尤为突出。特别是近期相关研究显示SO2污染与中枢神经系统损伤和疾病发生有关,由于其超越了传统观念,提出了新的、更为严峻的危害理念,得到广泛关注。由此提出本课题,研究SO2对中枢神经元的损伤效应,在此基础上探讨效应发生的可能信号通路。 1.本课题通过对雄性Wistar大鼠进行动式SO2熏气染毒,每天6h,连续7d,染毒剂量为7,14,28和56mg/m3,探讨了SO2诱导海马神经元损伤的效应。采用分光光度法测定大鼠海马组织蛋白质羰基含量,采用酶联免疫技术测定海马组织促炎症因子白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平,采用荧光标记法测定海马组织胞内钙离子水平,采用实时定量RT-PCR和Western blot分别测定海马组织凋亡相关基因c-fos, c-jun, p53, Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达,以及采用HE和TUNEL染色考察海马区切片的病理损伤和神经元凋亡的数量;并进一步通过原代培养大鼠海马神经元进行不同时间(6,12和24h)和不同浓度(3,10,30,100和30OμM)的SO2衍生物暴露染毒,考察以上凋亡基因在暴露染毒前后mRNA和蛋白表达水平的变化。结果表明:SO2可显著增加蛋白质羰基(PCO)含量;SO2可引起海马区促炎症因子IL-1β和TNF-a水平显著升高,且低浓度下作用明显;SO2可显著增加神经元胞内钙离子(Ca2+)浓度;SO2通过其衍生物显著上调海马神经元凋亡相关基因c-fos, c-jun和p53 mRNA和蛋白表达,以及Bax和Bcl-2 mRNA和蛋白的比值,且呈现明显的剂量-效应关系。这一结果分别从整体和细胞水平上,说明了SO2对大鼠海马神经元的损伤效应,并提示此效应的发生与氧化应激、炎症反应和神经元凋亡密切相关,但其分子调控机制还不清楚。 2.为了进一步阐明SO2诱导海马神经元损伤的信号途径及环氧合酶-2(COX-2)作为此效应标记的可能性,本实验通过对原代培养大鼠海马神经元并进行SO2衍生物暴露染毒,考察了SO2诱导大鼠海马神经元凋亡效应及COX-2作为此效应标记的可能性。在此基础上,通过特异性阻断技术按照“COX-2表达增加→前列腺素E2(PGE2)通过其相应受体PGE2受体(EP24)调节谷氨酸释放→N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体通道激活→钙稳态改变→神经元凋亡”的递进顺序,探讨效应发生的可能信号通路,确立阻断此通路的可能靶位点。结果表明:(1)S02衍生物上调大鼠海马神经元COX-2表达,进而激活caspase-3诱导神经元凋亡;COX-2抑制剂NS398和ShRNA沉默COX-2基因表达可显著抑制SO2衍生物诱导凋亡效应的发生(2)SO2衍生物可造成COX-2催化AA合成的PGE2的过量释放并作用于其受体EP24,导致与其耦联的环腺苷酸(cAMP)水平明显上调,最终引发神经毒性;NS398和ShRNA沉默COX-2基因表达可显著抑制此效应;(3)SO2衍生物诱导神经元损伤的可能信号途径为:SO2吸入→通过其代谢衍生物形成自由基造成氧化损伤→炎症反应-COX-2表达增加→突触后PGE2水平升高并作用于突触前膜EP2/EP4受体调节谷氨酸释放→激活NMDA受体通道→提高胞内游离钙离子浓度→神经元凋亡,在此过程中,COX-2介导的花生四烯酸(AA)脂质代谢反应是一个重要的调控环节。 3.为了在体条件下验证上述可能的信号途径及以COX-2为标记的损伤效应,本实验通过对大鼠进行不同浓度SO2动式熏气染毒和腹腔注射NS398预处理后再对大鼠进行SO2熏气染毒,在体条件下考察该通路可能靶位点的表达变化。结果表明:SO2吸入可显著增加海马组织COX-2表达,PGE2含量,EP2/EP4受体表达,cAMP水平和NMDA受体表达,诱导凋亡发生;腹腔注射NS398预处理后可显著抑制S02吸入诱导的COX-2表达,PGE2含量,EP2/EP4受体蛋白表达,cAMP水平和NMDA受体(NR2B)蛋白表达的增加,及caspase-3的激活。本研究阐明了SO2对中枢神经元的损伤效应及COX-2作为此效应标记的可能性,建立了检测和评价指标;确立了损伤发生的信号途径,找出了阻断的靶位点,为SO2吸入后中枢神经系统损伤相关分子调控机制的研究和污染事件发生时的临床治疗提供理论依据。 4.上述研究结果表明,SO2可诱导神经元凋亡的发生,在此过程中COX-2通过介导的AA代谢参与突触信号传递是细胞分子水平的重要调控环节。而大量研究表明,COX-2在神经元突触传递中扮演重要的角色。由此推断,SO2可能会参与突触信号传递过程,进而影响神经功能。为此,本实验通过对大鼠进行不同浓度SO2动式熏气染毒,采用透射电镜观察海马区神经元突触超微结构的改变,并采用Western blot分别测定大鼠海马神经元突触标记因子突触素(Syp)和突触后致密物-95(PSD-95)的表达,及考察突触可塑性维持因子胞外调节激酶(ERK)和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的激活。结果表明:(1) S02吸入暴露可诱导大鼠海马区神经元突触间隙减小,界面曲率增加,突触后致密物增厚,突触前突触小泡数目增多。(2)S02吸入暴露可浓度依赖性地上调Syp和PSD-95的蛋白表达,及抑制p-ERK1/2和p- CREB的蛋白表达。这一结果表明SO2通过改变神经元突触信号传递效能,影响突触可塑性,诱导海马神经元损伤并影响其恢复。 通过本项目研究,阐明了SO2通过其衍生物诱导海马组织氧化应激和炎性反应,并造成神经元凋亡效应及COX-2作为此效应标记的可能性,建立了进行检测和危险度评价的生物标记;确立了SO2诱导海马神经元损伤发生的信号途径,找出了阻断的靶位点,在此基础上探讨了SO2对突触信号传递过程的影响,为污染事件发生时的临床治疗提供理论依据。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:X174

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【参考文献】
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