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飞蝗漆酶基因mRNA表达及功能研究

余志涛  
【摘要】:漆酶(Laccase)属于酚氧化酶,是一种结合多个铜离子的蛋白质,可将酚类物质(如多巴胺)氧化成相应的醌,在昆虫的生长发育和变态过程中发挥着重要作用。漆酶主要参与昆虫表皮鞣化,促进表皮的硬化和暗化,这个过程对于昆虫的生长发育至关重要。直翅目昆虫飞蝗是重要的农业害虫,常暴发成灾,对农业生产构成严重威胁。目前,漆酶在分子水平上的研究主要集中在完全变态昆虫,而在不完全变态昆虫中尚未见报道。本文以飞蝗Locusta migratoria为研究对象,对漆酶基因(Laccase)进行了分子特性及功能研究,这对深入了解漆酶在飞蝗表皮形成过程中的作用提供了基础资料,丰富了目前昆虫漆酶的研究内容,同时为研发以该酶为靶标的新型飞蝗绿色防控新技术提供科学依据。本文主要研究内容有如下三个方面: 一、飞蝗漆酶基因的克隆及序列分析 基于飞蝗表达序列标签(Expressing sequence tag, ESTs)数据库,采用生物信息学方法获得2条漆酶ESTs,经比对确定其分别为Laccasel和Laccase2cDNA序列片段,分别将其命名为LmLacl和LmLac2。其中LmLacl的部分核苷酸序列长为757bp,编码252个氨基酸;LmLac2的部分核苷酸序列长为509bp,采用RACE技术克隆获得2026bp LmLac2cDNA序列,其中开放式阅读框(ORF)为1866bp,编码621个氨基酸,3’非编码区(3’-UTR)的长度为160bp。 二、飞蝗漆酶基因在不同发育阶段及不同组织部位的mRNA表达分析 采用qPCR技术对漆酶基因在不同龄期和不同组织部位的mRNA表达水平进行了分析。结果显示:LmLacl主要在中肠表达,而LmLac2在体表特异性表达;LmLacl在各个龄期都有表达,其中在卵期表达量最低,成虫期第5天表达量达到最高;LmLac2在5龄第一天不同时间段的表皮中(0h,2h,4h,8h,24h)都有表达,且随着体表暗化程度的加深,表达量呈上升趋势,之后,LmLac2在5龄每一天均有表达,虽然表达量最高的第1天是表达量最低的第5天的3.9倍,但统计学分析无显著性差异。 三、飞蝗漆酶基因的功能研究 采用RNAi技术研究飞蝗漆酶基因在生长发育过程中的功能。飞蝗4龄若虫注射dsRNA(dsLmLacl/dsLmLac2)后,检测到目标基因的表达均被有效沉默。dsLmLacl注射组与dsGFP注射组相比,体壁鞣化程度相同,且无致死现象;dsLmLac2注射组中,若虫蜕至下一龄期均出现体色变淡,虫体变软,活动能力下降等现象。为了进一步研究LmLac2基因沉默后是否对之后各发育龄期若虫的表皮鞣化都有影响,选取2龄第1天若虫注射dsRNA,之后取每一龄期的表皮做石蜡切片观察分析,发现dsLmLac2注射组的若虫在蜕至3龄和4龄后与对照组相比,其表皮明显变薄,但蜕至5龄的若虫表皮厚度与对照组无差异。这些结果表明,漆酶LmLacl不是表皮鞣化所必需的,而LmLac2对飞蝗表皮的硬化和暗化起着重要的作用。 四、中华稻蝗几丁质合成酶1基因的mRNA表达及功能 根据已知中华稻蝗几丁质合成酶1基因(OcCHSl)保守区域部分cDNA序列(GenBank登录号:HM214491),运用RT-PCR和qPCR技术分析mRNA表达特性,采用RNA干扰技术研究其生物学功能。结果表明,OcCHSl在中华稻蝗各龄期都有表达,其体表为高表达,其次是气管,其它组织部位表达量低。RNA干扰实验发现,4龄第4天若虫注射OcCHSl的双链RNA(dsRNA)后,与对照组相比, OcCHSl mRNA表达量被沉默了70.8%,稻蝗出现蜕皮延迟、不能完成蜕皮或腹部皱缩死亡等现象,注射dsOcCHSl组死亡率为85.2%,与对照组(7.4%)相比差异显著。这些结果表明:几丁质合成酶1主要参与体表和气管几丁质的合成,对中华稻蝗的生长发育具有重要作用,RNA干扰使该基因沉默后可导致虫体死亡。


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