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《山西大学》 2013年
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不同作物光合特性比较及籽粒苋C_4途径关键酶基因的原核表达

张忠梁  
【摘要】:C4植物有“CO2泵”浓缩机制,在高温,强光,干旱等逆境条件下,具有高的光合效率和生物学产量。通过基因工程技术,将C4途径关键酶基因转入C3作物,有利于提高C3植物光合效率,增强对高温、干旱等恶劣环境的适应,提高产量。本研究通过比较了C4与C3作物,双子叶与单子叶植物的光合特性,通过Southern blot明确了C4途径关键酶PEPC基因在双子叶C4植物籽粒苋基因组中的拷贝数,构建了籽粒苋PEPC基因和另一个C4途径关键酶NAD-ME基因的原核表达载体,并且这2个基因在Transetta (DE3)菌株中高效表达。 (1)利用CB-1102便携式光合蒸腾仪对籽粒苋、玉米和烟草的光合特性进行测定,Excel2007及SPSS软件对数据进行统计分析。结果表明:C4植物籽粒苋和玉米净光合速率(Pn)高于C3单子叶植物烟草;三种作物净光合速率对光照的响应为正相关,Pn随光照的增强而增大;籽粒苋及玉米Pn与温度的关系在20-40℃范围内呈正相关,烟草Pn与温度在15-30℃范围内呈正相关,35-40℃范围内Pn随温度的升高而降低。 (2)通过CTAB法提取籽粒苋基因组DNA,凝胶电泳和紫外可见分光光度计进行定量和定性分析。利用多种限制性内切酶酶切基因组DNA,纯化回收,0.7%凝胶电泳、转膜、固定及免疫检测。利用DIG标记的PEPC基因作为探针进行Southern杂交,初步确定籽粒苋基因组中PEPC基因的拷贝数为3个。 (3)以质粒pUC18T-PEPC为模板,PCR扩增得到PEPC基因的全长cDNA,长度为2895bp(GenBank登录号为HQ186302),编码964个氨基酸。以pSURE-aME-cDNA为模板,PCR扩增得到ME基因cDNA全长,长度为1872bp (GenBank登录号为HQ186303),编码623个氨基酸。通过基因重组构建pEASY-E1-(NAD)-ME和pEASY-E1-PEPC原核表达载体,经PCR、酶切鉴定及测序,表明目的基因PEPC和ME成功插入原核表达载体pEASY-E1。 将重组质粒pEASY-E1-(NAD)-ME和pEASY-E1-PEPC电转入Transetta (DE3)感受态细胞中,37℃、200rpm过夜培养。按1:100比例将培养菌液接入100mLLB液体培养基中(含氨苄青霉素)。37℃,200rpm摇菌3-4小时,OD600为0.4-0.6时,30℃条件下,经1mmol/LIPTG分别诱导2、4、6h,SDS-PAGE凝胶电泳结果表明目的蛋白成功表达。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S519

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【参考文献】
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