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《山西大学》 2014年
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纳米钻石靶向载药体系的制备及其与细胞相互作用的研究

王东新  
【摘要】:由于环境污染日益严重和人们不良的生活习惯,导致癌症的高发病率,以及现代医学对于癌症治疗的低效,导致其高的死亡率。在传统的癌症治疗方法中,化学疗法被认为是最简便有效的方法之一。但是由于癌症确诊较晚,以及抗癌药物多为小分子化合物,血液给药后快速扩散,分布于全身,在杀死肿瘤细胞的同时也对分裂较快的正常细胞有较大的毒副作用,且多次给药后肿瘤细胞易产生多药耐药性,特别是固态肿瘤,从而导致化疗的失败。随着纳米技术的发展,纳米医药为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。纳米技术在影像医学诊断中的应用可提高其检测灵敏度,如磁共振成像技术、超声成像技术及x-射线计算断层摄影技术等,近期随着活体成像技术和多光子激发扫描技术等的发展,推动了荧光成像在肿瘤诊断中的应用,这些新技术的发展使肿瘤的早期确诊成为可能。此外利用肿瘤新生血管的不完整结构导致纳米颗粒在肿瘤附近的高透过高滞留效应,可将抗癌药物制备成纳米药物或装载在纳米载体上可达到被动靶向治疗肿瘤的效果,进一步在纳米颗粒表面修饰一些与肿瘤细胞或新生血管具有特异性结合的配体,得到主动靶向到肿瘤的目的,即靶向输送药物体系。该体系可以降低抗癌药物的用量和毒副作用,同时也可抑制肿瘤细胞的多药耐药性,提高治疗效率。现研究的纳米载体材料主要有脂质体、高分子聚合物、碳纳米管、胶束、纳米微球及一些天然高分子化合物等。最近,具有生物相容性好、光学与化学性质稳定、合成技术成熟和表面易于修饰等诸多优点的纳米钻石在生物领域的应用成为当前研究的热点,以纳米钻石作为药物载体和荧光成像试剂还处于研究初期。本论文以爆炸合成的纳米钻石(ND)作为载体材料,聚乙二醇(PEG)作为交联剂,转铁蛋白(Tf)为靶向分子,对ND进行修饰制备得到靶向肿瘤细胞的纳米载体。以阿霉素(DOX)为药物模型,正常人肝细胞(L-02细胞)和肝癌细胞(HepG2细胞)为细胞模型,对纳米载药体系与细胞的相互作用和载药体系在细胞内的药物缓释及靶向性进行了研究。具体研究内容如下:1.使用电导返滴定法对强酸氧化处理后的ND表面羧酸含量进行测定,计算得到每个粒径为~140 nm的ND粒子表面含有3.36x 105个羧基。2.对ND物理吸附行为进行了研究,结果表明,Cit3-可以加强ND对DOX的吸附,同时验证了Cl-可以调控DOX从ND上的解离;对Tf的吸附行为符合Langmuir等温吸附,在PBS (pH7.4)中最大吸附量为(176.46±2.13)μg/mg,在pH(5.5)等于Tf的等电点附近有最大吸附,可能是因为Tf在等电点时溶解度最小,与ND的疏水作用力增大,吸附能力增强。利用激光共聚焦和流式细胞仪对ND和ND-Tf内吞到HepG2细胞的差异进行了定性和定量分析,结果得到ND-Tf比ND容易内吞到细胞中,利于可发荧光的ND在胞内成像。3.对ND进行PEG修饰后可提高其分散性,利于细胞内吞。对细胞内吞ND-PEG-DOX纳米载药体系进行了研究,证明HepG2细胞内吞ND-PEG-DOX的速率比游离DOX慢2倍,但是进入细胞的DOX量明显比游离的DOX内吞量增加,并降低了DOX的细胞毒性。使用流式细胞仪测定细胞内吞ND-PEG-DOX后胞内ND的荧光强度与侧向角的变化呈一致的趋势,故可以使用侧向角的变化来判断细胞内吞纳米颗粒的量。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内吞ND-PEG-DOX的过程,表明FND-PEG-DOX对DOX具有缓释效应。细胞内吞ND-PEG-DOX的机理为网格蛋白介导的内吞过程,与DOX的自由扩散进入细胞的机理不同。4.以Tf为靶向分子,成功构建了ND-PEG-Tf纳米靶向药物载体,使用流式细胞仪测定细胞内ND的荧光强度表明细胞内吞ND-PEG-Tf是时间和浓度依赖的。细胞内吞ND-PEG-Tf的量与细胞表而表达TfR的量密切相关,利用Fe3+存在下游离Tf的抑制试验证明细胞内吞ND-PEG-Tf是由TfR介导的。依据高表达TfR的肿瘤细胞和低表达TfR的正常细胞差异,ND-PEG-Tf可选择性的进入肿瘤细胞,靶向输送药物。使用MTT法对ND-PEG-Tf-DOX纳米载药体系的细胞毒性进行了研究,结果表明ND-PEG-Tf-DOX对TfR表达较高的肿瘤细胞具有较大的细胞毒性,而与游离DOX的细胞毒性相比,ND-PEG-Tf-DOX可减小对TfR表达较低的正常细胞的毒性,即减小DOX的毒副作用。因此ND-PEG-Tf作为靶向药物输送载体对肿瘤的治疗具有潜在的应用。5.对HepG2细胞内吞ND-PEG-Tf纳米颗粒后的生长曲线证明ND-PEG-Tf不影响细胞的生长,同时使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定得到细胞内的ND-PEG-Tf会随细胞分裂将其传到子细胞中,随着分裂次数的增多,导致胞内ND-PEG-Tf纳米颗粒量的减少。结果表明ND-PEG-Tf是生物相容的,可作为纳米药物载体用于靶向输送药物。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:TQ460.1;TB383.1

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