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《山西大学》 2016年
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河南华溪蟹生殖调控基因vasa的克隆和原核表达

李怡婷  
【摘要】:vasa基因编码一种ATP依赖的RNA解旋酶,属于DEAD-box家族,最先在果蝇(Drosophila)中被发现。vasa基因在生殖细胞中特异表达,在动物生殖细胞发生和生殖调控中发挥着重要作用,被用作生殖细胞的分子标记物,主要用于配子发生和原生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的起源、迁移和分化等方面的研究。本文通过RACE技术克隆得到了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)vasa基因cDNA序列,证实了vasa基因仅在生殖细胞中特异表达;构建了河南华溪蟹VASA蛋白原核表达载体Vexp-28a、Vexp-32a、Ve-28a及Ve-32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了原核表达。本文克隆得到的河南华溪蟹vasa基因cDNA序列长2896bp,其中编码区长1329bp,编码442个氨基酸的蛋白。Blast比对结果表明由该cDNA序列推测翻译的蛋白氨基酸序列与鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类以及一些无脊椎动物的VASA蛋白氨基酸序列有较高的相似性;结构域分析也表明该氨基酸序列具有DEAD-box家族共有的4个保守motif(motifⅠ、motifⅠa、motifⅠb、motifⅡ)、一个锌指结构和GG重复序列,还具有VASA亚家族基因专一性特征结构,如Q-motif、RGG重复序列和甘氨酸富集区,与DEAD-box家族蛋白具有的8个保守结构域motifⅠ、motifⅠa、motifⅠb、motifⅡ、motifⅢ、motifⅣ、motifⅤ、motifⅥ以及两个锌指结构、一个Q-motif,GG重复的结构相比,本文获得的蛋白氨基酸序列在motifⅡ之前(包括motifⅡ)的序列是正确的,但在motifⅡ之后的序列中,由于一些原因使蛋白翻译提前终止,因此,我们所得到的Sh-vasa基因cDNA序列的3'端还待进一步验证;多序列比对和系统进化分析显示该cDNA序列编码的氨基酸序列与其它虾蟹类的VASA蛋白进化关系最近。以上结果均表明,本文所获得的cDNA序列确定为河南华溪蟹vasa基因5'端及部分编码区cDNA序列。通过半定量PCR(Sq-PCR)监测河南华溪蟹vasa基因在不同组织中的表达情况,结果显示,vasa基因在河南华溪蟹体内仅在生殖细胞中特异表达。以得到的河南华溪蟹vasa基因cDNA序列为基础,设计两对引物,通过PCR,在选定的vasa基因片段两端加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,然后利用基因重组技术将获得的vasa基因表达片段分别克隆至pET-28a、pET-32a原核表达载体,经酶切鉴定和测序,成功构建河南华溪蟹VASA蛋白原核表达载体Vexp-28a、Vexp-32a、Ve-28a及Ve-32a,并通过IPTG诱导进行原核表达,蛋白上清和包涵体沉淀分别经过His·Tag亲和层析柱分离、纯化,通过SDS-PAGE分析以及Western blot鉴定,所得蛋白并非河南华溪蟹VASA融合蛋白,需在河南华溪蟹vasa基因cDNA序列内重新选取表达片段,或重新选择表达载体,改进实验方案,再次实验,以期获得河南华溪蟹VASA融合蛋白。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S917.4;Q78

【参考文献】
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