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《山西大学》 2016年
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Fe~(2+)对红球菌R04 CYP125A18与唑类药物相互作用的影响

徐洋  
【摘要】:细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450)是一类含有铁血红素的单加氧超家族,分布十分广泛,如细菌、真菌和高等生物中,具有转化内源性物质(如胆固醇、类固醇、脂肪等)和催化外源性物质(如药物、环境物质)的功能。在原核生物中,CYP450表现出丰富的多样性,如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的CYP家族有20个细胞色素P450单加氧酶,其中CYP125是胆固醇分解代谢起始的关键酶,可以解除4-胆甾烯-3-酮的毒性,且唑类药物对其有明显的结合抑制作用。红球菌(Rhodococcus sp.)R04基因组有15种细胞色素P450单加氧酶,其中CYP125A18与结核分枝杆菌和马红球菌(Rhodococcus equi)的CYP125有较高同源性。本研究对CYP125A18基因进行了克隆表达,通过纯化过程中添加Fe2+,获得了含外源铁的CYP125A18-Fe;并用紫外分光光度法对两种蛋白的光谱特性以及与底物、唑类药物互作情况进行分析,测定了两种蛋白的圆二色光谱且与底物、唑类药物结合后两种蛋白圆二色光谱的变化。实验结果表明,氧化态CYP125A18血红素铁大部分是低自旋状态,少部分为高自旋状态,而氧化态的CYP125A18-Fe血红素铁几乎全部是高自旋状态;CYP125A18还原态和CO结合后与CYP125A18氧化态的差示光谱表现为典型的CYP450光谱特性;CYP125A18-Fe蛋白也有类似的实验结果,但450nm处吸收较CYP125A18弱。CYP125A18与底物4-胆甾烯-3-酮结合后,血红素铁全部转变为高自旋状态,CYP125A18-Fe与底物4-胆甾烯-3-酮结合后,紫外光谱发生明显改变,部分血红素铁恢复低自旋状态。在对两种蛋白的圆二色光谱的测定中发现,CYP125A18、CYP125A18-Fe蛋白的圆二色光谱没有明显差异,说明Fe2+没有影响蛋白的二级结构。根据两种蛋白与底物4-胆甾烯-3-酮结合后测定的圆二色光谱,与蛋白的圆二色光谱计算所得的二级结构数目对比发现数值基本一致,说明CYP125A18与底物结合后其二级结构基本不发生改变,且Fe2+基本不影响蛋白与底物的结合。两种蛋內与唑类药物结合后的圆二色光谱计算所得的二级结构发生αα螺旋向β折叠的转变,说明唑类药物改变了两种蛋白的二级结构,且三唑类药物对蛋白的二级结构影响更为剧烈;但两种蛋白的圆二色光谱差别不明显,说明Fe2+的加入对蛋白与唑类药物的结合基本没有影响。CYP125A18与唑类药物滴定后发生了Ⅱ型光谱转变,CYP125A18蛋白与唑类药物结合的解离常数表明,七种唑类药物与CYP125A18的亲和力由强到弱依次为酮康唑、益康唑、4-苯基咪唑、氟康唑、4-甲基-2-苯基咪唑、克霉唑、甲硝唑。CYP125A18-Fe蛋白与唑类药物结合后,光谱变化明显异于CYP125A18蛋白,在370nm和415nm左右的吸收均有增加,但差谱变化量与CYP125A18差异不大,计算所得与七种唑类药物的结合常数所展示的亲和力由强到弱的顺序与CYP125A18相同,进一步说明Fe2+的加入没有影响CYP125A18蛋白与唑类药物的结合。上述实验对阐明CYP125A18代谢胆固醇具有重要意义,同时为疾病耐药性研究及药物选择方面提供数据和理论支持。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78

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