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《山西大学》 2017年
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铅对河南华溪蟹雄性生殖系统的损伤和毒性机制研究

李娜  
【摘要】:本博士学位论文研究了铅对河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)精巢、副性腺和精子的损伤作用与毒性机理。用急性染毒方法,Pb浓度设计为3.675、7.35、14.7、29.4和58.8 mg/L,染毒时间3 d、5 d和7 d。对精巢和副性腺,一是采用火焰原子吸收法检测了铅在组织中的蓄积量;二是运用光镜技术观察了组织显微结构的病理变化;三是采用比色法测定了铅对超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量以及酸性磷酸酶(ACP)活性的影响,旨在了解铅对精巢和副性腺的毒性作用。在此基础上,运用TUNEL技术和透射电镜技术检测了铅对精巢细胞的凋亡情况,并分别用酶组织化学法和RT-PCR技术测定了精巢中caspase-3,-8,-9的活性和caspase-3,-8,-9 mRNA的表达量,对凋亡机制进行了探讨。同时应用钙离子载体A23187诱导法,探究了副性腺在诱导精子顶体反应过程中的作用,以及通过测定副性腺中活性氧(ROS)、蛋白质羰基化(PCO)、DNA-蛋白质交联率(DPC)含量,研究了铅对副性腺功能的影响和毒性机理。对于精子,首先采用伊红Y染色法、流式细胞术、AO荧光标记法对精子成活率、精子顶体膜和质膜的完整性,以及DNA的完整性进行了测定,探究了铅对精子质量的影响程度;其次检测了精子ROS含量和总抗氧化能力(TAC)的变化,以及MDA、PCO和DPC含量变化,研究了铅对精子中脂质、蛋白质和DNA的氧化作用。还有,为了分析铅是否通过干扰Ca~(2+)对精子产生致毒效应,在检测了精子顶体反应诱导率和顶体酶活性之后,分别利用荧光显微镜和酶标仪动力学方法,检测了铅暴露对精子中[Ca~(2+)]的影响,以及ELISA法检测了铅暴露后精子中钙调蛋白(CaM)的含量变化,同时分析了加维拉帕米(VRP)对铅所引起的精子的氧化损伤的效应。研究结果如下:1.铅对河南华溪蟹精巢和副性腺组织细胞形态结构的改变和氧化损伤作用铅暴露使Pb~(2+)在河南华溪蟹精巢和副性腺中富集。光镜观察发现,精巢对照组生发区内生精细胞层次分明,排列整齐,管腔内可见染色较深的正常形态的精细胞。铅暴露后,出现了不同程度的组织病变,例如生精细胞排列紊乱、生精细胞与精细胞数量减少、生发层出现空泡等。副性腺对照组管壁细胞排列紧密,管壁由外向内依次为结缔组织、基膜和上皮。铅染毒后,出现了不同程度的结缔组织缺失、上皮细胞与基膜脱离、上皮细胞的细胞质和细胞核分离,细胞核变形等现象。两个组织中SOD、GPx、CAT活性在同一染毒时间内随着铅染毒浓度的增加先升后降。低浓度铅显著诱导抗氧化酶活力的升高,而高浓度铅处理组酶活力下降甚至低于对照组水平。随着铅染毒浓度的增大和染毒时间的延长,精巢和副性腺中MDA含量呈现逐渐升高的趋势,ACP活性呈现下降趋势。2.铅诱导河南华溪蟹精巢组织细胞发生了凋亡现象随着铅浓度的增加,精巢中ROS含量呈现增高的趋势;电镜观察到正常的精巢内,生精细胞细胞核呈规则的圆形或椭圆形,线粒体结构形态正常,有完整的嵴。铅染毒后,细胞核膜开始收缩变形,少量线粒体外膜有断裂现象,严重损伤的线粒体嵴消失,出现空泡化。TUNEL技术检测精巢生精细胞凋亡后发现,对照组基本没有细胞发生凋亡,铅浓度58.8 mg/L处理后,荧光显微镜下看到绿色荧光细胞核明显增多,说明此时的凋亡细胞数目增多;酶活性测定和RT-PCR结果显示,高浓度组caspase-3,-9的酶活性和mRNA表达量均增高。但是,caspase-8的酶活性和mRNA表达量在各染毒浓度组与对照组比较均没有显著性变化。3.铅染毒河南华溪蟹的副性腺对诱导精子顶体反应的影响用卵水、副性腺匀浆、A23187、卵水+A23187、副性腺+A23187五种不同的诱导方式,对河南华溪蟹的精子进行顶体反应诱导实验。结果发现,当副性腺和A23187共同存在时,顶体反应诱导率最高,高达78%,而其他诱导方式效果不明显。说明河南华溪蟹副性腺具有调节精子顶体反应的作用;用铅染毒后的副性腺作为调节物进行精子顶体反应体外诱导时,精子顶体反应诱导率明显下降;在染毒5 d和7 d的高浓度铅处理组,副性腺中ROS含量和PCO含量与对照比显著升高,但DPC水平在所有染毒时间和染毒浓度下无显著性变化。4.铅对河南华溪蟹精子质量的影响及氧化损伤铅暴露使Pb~(2+)在河南华溪蟹精子中富集。随着铅浓度的增大和染毒时间的延长,精子的成活率、精子顶体膜和质膜完整性以及DNA的完整性下降。铅暴露后,精子中ROS含量升高,而总抗氧化能力TAC较对照的降低;ROS含量升高和TAC能力的降低导致了精子中的脂类、蛋白质和DNA受到了氧化损伤,MDA含量、PCO含量和DPC水平出现了显著升高。5.铅对河南华溪蟹精子中钙离子的影响铅可以降低河南华溪蟹精子顶体反应诱导率和顶体酶活性;将钙离子荧光探针Fluo-3/AM装载到精子中,不论荧光显微镜观察到的荧光强度,还是用酶标仪检测到的荧光值都显示,Pb+A23187处理组的[Ca~(2+)]比A23187单独作用时低,可见铅暴露降低了精子中[Ca~(2+)];同时,ELISA方法检测结果显示,铅暴露使精子中CaM含量增加;在铅和VRP共同作用时,精子成活率、DNA完整性、MDA以及PCO含量比单独铅作用时都有接近对照组的趋向。表明VRP存在时可减轻铅胁迫所造成的对精子的氧化损伤作用。从研究结果得出如下结论:1.铅胁迫导致河南华溪蟹精巢和副性腺发生了严重的氧化损伤,其作用机制与抗氧化酶活力的变化和脂质过氧化加剧有关。铅通过降低精巢和副性腺中ACP活性造成对雄性河南华溪蟹的生殖毒性。2.铅诱导使河南华溪蟹精巢生精细胞发生了细胞凋亡,凋亡的发生主要是通过线粒体介导的凋亡通路实现的。3.铅对河南华溪蟹副性腺有明显的生殖毒性,可降低其在精子顶体反应诱导过程中的调节作用。主要原因是铅诱导产生的ROS使副性腺中蛋白质发生了氧化损伤。4.铅染毒导致河南华溪蟹精子质量显著下降,其作用机制与精子的氧化损伤加剧有关,铅通过Ca~(2+)通道进入精子并对精子致毒。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:X171.5

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