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《山西大学》 2017年
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飞蝗表皮几丁质有序排列关键基因的功能研究

于荣荣  
【摘要】:昆虫表皮覆盖整个虫体,对昆虫生长发育具有重要作用。几丁质是表皮的主要成分,其致密排列组装成精细的表皮结构。由于人类和高等动物体内不含几丁质,因此表皮可做为害虫防治的安全靶标。表皮几丁质的有序排列对维持表皮结构的完整性至关重要,表皮几丁质排列关键基因的筛选及功能研究将揭示表皮形成的分子机制,为害虫防治靶标的研究提供重要的理论依据。本文以飞蝗(Locusta migratoria)为研究材料,分别对3类几丁质排列关键基因的生物学功能进行探讨。研究内容如下:一、飞蝗几丁质脱乙酰基酶(CDAs)基因鉴定和分子特性从飞蝗转录组数据库搜索获得的CDAs序列进行全长验证、功能域分析并构建系统聚类树,获得4条CDAs的全长cDNA序列,分别将其命名为LmCDA1、LmCDA2、LmCDA4和LmCDA5,其中LmCDA2和LmCDA5分别具有2个剪切子,分别为LmCDA2a和LmCDA2b及LmCDA5a和LmCDA5b。采用(reverse transcriptionquantitative PCR,RT-qPCR)技术对其分子特性进行研究,对各组织部位CDAs表达水平进行检测,结果表明LmCDA1和LmCDA4在前肠表达量最高,在体壁和后肠次之。LmCDA2a和LmCDA2b在前肠的表达量显著高于其他组织。LmCDA5在前肠中表达量最高,体壁、后肠和脂肪体次之。对5龄不同天数体壁CDAs表达水平进行检测,结果表明LmCDAs均在第1和2天表达量最高,随着天数的增加呈现逐渐降低的趋势,而在蜕皮前表达量升高,暗示LmCDAs在飞蝗蜕皮前后发挥着重要作用。二、飞蝗几丁质脱乙酰基酶(CDAs)基因的生物学功能采用RNAi(RNA interference)技术对CDAs生物学功能进行研究,结果表明分别注射CDAs的dsRNA(double-strand RNA)可以特异、高效的沉默靶标基因,且注射dsLmCDA1、dsLmCDA2和dsLmCDA2a后,飞蝗出现难以蜕去旧表皮并最终导致死亡的表型,而注射dsLmCDA2b、dsLmCDA4和dsLmCDA5的虫体可以成功蜕至下一龄期,未观察到可见的异常表型。HE染色结果表明,与对照组相似,注射dsLmCDA1和dsLmCDA2后,飞蝗经历皮层溶离,新表皮合成加厚和旧表皮降解变薄的过程,无肉眼可见的表型。免疫组化结果表明,LmCDA2位于原表皮最上层,LmCDA1主要位于皮细胞层,此外在外表皮也有可见的荧光信号。壳聚糖染色结果表明,注射dsLmCDA1后,壳聚糖含量显著降低,表明几丁质脱乙酰度降低,而注射dsLmCDA2后,与对照组相比,其壳聚糖含量不变,表明几丁质脱乙酰度未发生改变。透射电镜观察结果表明,注射dsLmCDA1后,仍旧可观察到几丁质片层结构,表皮变薄,而注射dsLmCDA2后,几丁质片层结构消失,表皮变厚。将LmCDA1和LmCDA2同时沉默后,几丁质片层结构消失,其表皮厚度介于分别将LmCDA1和LmCDA2沉默后的表皮厚度之间,表明LmCDA2在表皮几丁质排列中发挥重要功能,且LmCDA1和LmCDA2对表皮厚度的维持起着重要作用。几丁质含量检测结果表明,注射dsLmCDA1后,表皮几丁质含量显著降低,而注射dsLmCDA2后,表皮几丁质含量未发生变化,将LmCDA1和LmCDA2同时沉默后,几丁质含量显著降低。上述结果表明LmCDA1和LmCDA2在功能上存在分化。三、飞蝗Knickkopf(Knk)基因的分子特性和生物学功能从飞蝗转录组数据库中搜索获得的LmKnk序列进行全长验证,获得LmKnk全长cDNA序列。功能域分析结果表明,LmKnk包含三个保守功能域。聚类分析结果表明,LmKnk与其他昆虫的Knk家族聚为一支,将其命名为LmKnk。采用RT-qPCR对LmKnk进行分子特性研究,不同组织部位表达结果表明,LmKnk在前肠中表达最高,其次在体壁中表达较高。对LmKnk在5龄不同天数体壁中表达水平进行检测,结果表明LmKnk在五龄整个若虫期均有表达。预示LmKnk在5龄整个发育过程中起着重要作用。采用RNAi技术将合成的靶基因特异性的dsLmKnk注射到飞蝗体内,检测dsLmKnk对LmKnk基因的沉默效率并对其表型进行观察,结果表明dsLmKnk可以高效地沉默靶基因。且注射dsLmKnk后在若虫-若虫和若虫-成虫期飞蝗均出现蜕皮困难而死亡的表型。HE染色结果表明,注射dsLmKnk后,飞蝗依旧经历皮层溶离和旧表皮降解变薄,但与对照相比,新表皮显著变薄。采用几丁质染色实验对表皮中几丁质含量进行检测,结果表明新表皮中几丁质含量显著下降。透射电镜观察结果表明,注射dsLmKnk后表皮致密排列的几丁质片层结构消失,表皮变薄且孔道结构畸形。对表皮几丁质含量进行检测,结果表明,注射ds LmKnk后表皮几丁质含量降低。免疫组化结果表明LmKnk产生于皮细胞中,蜕皮时部分转移至新表皮中,表明其可能参与对新表皮的保护。四、飞蝗Retroactive(Rtv)基因的分子特性和生物学功能将飞蝗转录组数据库中已鉴定的LmRtv序列进行全长验证,获得LmRtv的全长cDNA序列。检测LmRtv在不同组织部位和不同天数体壁中的表达,结果表明LmRtv在前肠中表达量最高,且在5龄第1和2天表达量最高。注射dsLmRtv后,飞蝗出现蜕皮困难而致死的表型。HE染色结果表明,注射dsLmRtv后飞蝗依旧出现皮层溶离和旧表皮的降解,但新合成的新表皮量显著减少。透射电镜观察结果表明,注射dsLmRtv后新表皮片层结构消失,孔道结构膨大而不规则,表皮厚度与对照组相比显著变薄。几丁质含量检测结果表明,注射dsLmRtv后几丁质含量显著降低。本文研究发现,注射dsLmCDA1、dsLmCDA2、dsLmKnk和dsLmRtv后,均可导致飞蝗蜕皮困难而死亡的表型,且表型相似,难以将其区分开来。因此,进一步借助显微和超微技术对其进行深入观察,结果表明飞蝗出现蜕皮困难致死的原因不同,LmCDA1定位于皮细胞和外表皮,主要参与几丁质脱乙酰过程,维持表皮中几丁质与壳聚糖含量的平衡。LmCDA2位于原表皮的最外层,主要负责几丁质片层结构的形成。LmKnk定位于新表皮中,负责新表皮几丁质的沉积和几丁质片层结构的维持。而目前LmRtv的定位尚不清楚,其功能主要是参与新表皮几丁质的沉积,同时负责几丁质片层结构的维持。综上所述,本文系统地研究了表皮几丁质排列关键基因的生物学功能,丰富了昆虫表皮几丁质结构研究内容,筛选获得LmCDA1、LmCDA2、LmKnk和LmRtv表皮几丁质结构有序排列关键基因,为害虫绿色防控提供了潜在的分子靶标。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q963

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