中国重要蝗区东亚飞蝗有机磷杀虫剂抗性生化机制研究
【摘要】：
蝗灾是世界性的农业灾害，20世纪90年代以来，受异常气候及生态环境恶化等因素的影响，我国蝗虫发生逐年加重，特别是近年北方地区持续高温干旱，蝗虫孳生环境变化，以东亚飞蝗为主的蝗灾发生面积扩大，暴发频率提高，对我国农业生产构成严重威胁。我国目前控制蝗虫危害的手段主要是采用化学药剂来降低虫口密度，化学防治虽然具有快速、高效、使用灵活等优点，但是随着农药品种及数量的增加和无限制地使用农药，会导致引起蝗虫的抗药性、农药的效能降低、农药生产成本增加等一系列问题。东亚飞蝗某些自然种群对常用杀虫剂马拉硫磷的抗性已经引起了植保部门有关人员的注意。
自从1908年首次发现美国的梨圆蚧对石硫合剂产生抗药性以来，至今至少有600多种昆虫及螨已产生了抗药性。害虫对杀虫剂产生抗性的主要机制有代谢抗性和靶标抗性。代谢抗性是指对杀虫剂起水解或隔离作用的酶发生改变，从而对杀虫剂起到解毒作用，昆虫主要解毒酶系有酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、细胞色素P450单加氧酶等，这三种酶系任何一种的组成部分发生改变均会引起害虫抗性的改变；靶标抗性是指由于杀虫剂作用靶标敏感度降低而产生的抗性。杀虫剂的作用靶标主要有：有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的作用靶标—乙酰胆碱酯酶；DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标—神经轴突钠离子通道；环戊二烯类和吡唑类等杀虫剂的作用靶标—γ-氨基丁酸(GABA)受体-氯离子通道复合体。这两种抗性机理在果蝇、家蝇、棉铃虫、小菜蛾、蚊类等害虫中已经有深入的研究，为其它害虫的抗性机理研究提供了丰富的资料。
本文选取我国东亚飞蝗河北黄骅、河北平山、天津北大港和山东无棣四个杀虫剂选择压力不同的东亚飞蝗自然种群进行有机磷抗性相关酶的生化特性研究。河北黄骅、天津北大港和山东无棣三个蝗区生态特征相似，均靠近渤海湾，属于滨海蝗区，河北平山蝗区位于岗南水库库区，属于河泛蝗区。其中河北黄骅和天津北大港两个蝗区为我国重点蝗区，这两个东亚飞蝗种群的农药选择压力较大，河北平山和山东无棣种群较上述两个种群农药选择压力小。通过马拉硫磷对这四个东亚飞蝗种群的生物测定，结果表明，山东无棣和河北平山种群对马拉硫磷的敏感性较高，而天津北大港和河北黄骅种群的较低。天津北大港、河北黄骅及河北平山三种群对马拉硫磷的LD_(50)值分别是山东无棣种群的1.96、1.8及1.02倍，这说明，我国重点蝗区杀虫剂的选择压力已经造成当地东亚飞蝗种群对常用杀虫剂的敏感性下降。
对上述四个东亚飞蝗种群酷酶的生化特性进行了比较研究。东亚飞蝗中酷酶
活性主要集中在胸部和腹部，水解a~NA的酷酶活性在雌性东亚飞蝗中分别有
46.1%和36.1%集中在胸部和腹部，在雄性中分别为42.7%和36%。酉旨酶动力学
研究表明，东亚飞蝗中酷酶对a一A、a一B、p一A及p一A等四种模式底物均有
水解活性，其中a一NA为最适底物，而对p一A的水解活性较低。用对氧磷、马
拉氧磷、西维因及毒扁豆碱等四种抑制剂对这四个东亚飞蝗种群的酷酶进行体外
抑制实验，结果表明，四个种群中大部分酷酶属于B一型。酉旨酶活性在四个种群
中有明显差异，其中山东无棣种群对a一A、a一B及p一NA三种底物的水解活性
均为最低水平，在雌性种群中，河北黄骥、河北平山及天津北大港三个种群水解
a一A酉旨酶的活性分别是山东无棣种群的2.09、1.28和1.24倍;水解a一NB酉旨酶
的活性分别是山东无棣种群的6.30、3.79和1.61倍;水解p一A酉旨酶的活性分别
是山东无棣种群的2.06、1.21和1.29倍。在雄性种群中，河北黄弊、河北平山
及天津北大港三个种群水解a一A酉旨酶的活性分别是山东无棣种群的1 .71、1.53
和1.51倍;水解a一NB酉旨酶的活性分别是山东无棣种群的4.71、3.34和1.55倍;
水解p一A醋酶的活性分别是山东无棣种群的1.82、1.43和1.49倍。四个种群醋
酶活性大小的分布统计表明，四个种群酷酶活性在个体中的分布有明显差异，河
北平山种群和山东无棣种群水解三种底物的醋酶活性在低水平有分布，而河北黄
弊种群则有较多个体的醋酶活性分布在较高的水平，天津北大港种群个体酷酶活
性一致性较高，这可能与我们的取样有关。根据醋酶非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳
染色后，河北黄弊和天津北大港两个种群表现出相似的带型，在慢迁移率区有两
条明显染色较深的带，而河北平山和山东无棣两种群中，慢迁移率区只可分辨出
一条带，其它迁移较快的酷酶在四个种群间没有明显的差异，推测，天津北大港
种群酷酶活性可能与河北黄弊种群处于同一水平，且酷酶活性的增加可能是由这
两个迁移较慢的醋酶产生。结合四个种群对马拉硫磷的敏感性差异，分析认为，
河北黄弊和天津北大港两种群中酷酶活性的提高与马拉硫磷敏感性降低有关。对
江苏沛县、河南郑州、山西永济和山西临琦四个东亚飞蝗种群的64个个体(雌
雄各半)以a一NA为底物进行醋酶活性检测，结果表明，山西临椅和河南郑州两
个种群醋酶活性处于较低水平，而江苏沛县和山西永济两个种群醋酶活性水平较
高，它们之间的酷酶活性差异与该地区蝗虫防治的用药背景相关。提出，酉旨酶活
性可以
【关键词】：东亚飞蝗 有机磷 抗药性差异 酯酶 谷胱甘肽-S-转移酶 乙酰胆碱酯酶 亲和层析 【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：X174
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2004.077196
【目录】：
- 文中部分名词中英文对照及缩略语4-6
- 中文摘要6-10
- 英文摘要10-18
- 第一章 前言18-54
- 1.1 东亚飞蝗概述18-29
- 1.1.2 中国东亚飞蝗发生区的生态类型20-22
- 1.1.2.1 蝗区的概念20-21
- 1.1.2.2 东亚飞蝗发生区的生态类型21-22
- 1.1.3 国内外东亚飞蝗研究现状22-24
- 1.1.3.1 国外研究概况22-23
- 1.1.3.2 国内东亚飞蝗研究现状23-24
- 1.1.4 我国东亚飞蝗的为害及治理24-29
- 1.1.4.1 我国东亚飞蝗的为害24-25
- 1.1.4.2 我国东亚飞蝗的治理25-29
- 1.1.4.2.1 我国东亚飞蝗治理的发展进程25-26
- 1.1.4.2.2 我国东亚飞蝗可持续治理进展26-29
- 1.1.5 东亚飞蝗抗药性研究的意义29
- 1.2 有机磷杀虫剂的毒理作用29-31
- 1.2.1 有机磷杀虫剂的发展及其基本特点29-30
- 1.2.2 有机磷杀虫药剂的毒理作用30-31
- 1.2.3 马拉硫磷的基本特点31
- 1.3 昆虫抗药性研究概述31-52
- 1.3.1 昆虫抗药性的定义及监测方法31-36
- 1.3.1.1 昆虫抗药性的定义31-32
- 1.3.1.2 昆虫抗药性的监测方法32-36
- 1.3.2 昆虫抗药性机理的研究进展36-51
- 1.3.2.1 代谢抗性研究进展37-45
- 1.3.2.1.1 细胞色素P450氧化酶系与抗性的关系37-41
- 1.3.2.1.2 酯酶与抗性的关系41-43
- 1.3.2.1.3 谷胱甘肽-S-转移酶与抗性的关系43-45
- 1.3.2.2 靶标抗性研究进展45-51
- 1.3.2.2.1 乙酰胆碱酯酶靶标45-48
- 1.3.2.2.2 击倒抗性与神经轴突钠离子通道靶标48-50
- 1.3.2.2.3 γ-氨基丁酸(GABA)受体靶标50-51
- 1.3.3 害虫抗药性治理的对策51-52
- 1.4 本文研究的内容及目的52-54
- 第二章 东亚飞蝗对有机磷农药敏感性的生物测定54-59
- 2.1 材料与方法54-56
- 2.1.1 供试东亚飞蝗的采集及饲养54-56
- 2.1.2 供试药品56
- 2.1.3 生物测定的方法56
- 2.2 结果与分析56-57
- 2.3 讨论57-59
- 第三章 东亚飞蝗不同种群的酯酶特性研究59-84
- 3.1 材料与方法59-66
- 3.1.1 供试种群59-60
- 3.1.2 供试药剂60-61
- 3.1.3 酶液的制备61
- 3.1.4 酯酶活力的测定61-63
- 3.1.5 酯酶活性计算的标准曲线的测定63-64
- 3.1.6 酯酶动力学常数K_m、V_(max)的测定64
- 3.1.7 酯酶的体外抑制64-65
- 3.1.8 酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析65
- 3.1.9 蛋白浓度的测定65-66
- 3.2 结果与分析66-80
- 3.2.1 蛋白浓度测定和酯酶活性计算的标准曲线66-68
- 3.2.2 东亚飞蝗不同体段蛋白含量和酯酶活性比较68
- 3.2.3 东亚飞蝗不同种群酯酶活性的差异68-69
- 3.2.4 东亚飞蝗不同种群酯酶动力学常数的比较69-71
- 3.2.5 东亚飞蝗不同种群酯酶的体外抑制71-80
- 3.3 讨论80-84
- 3.3.1 东亚飞蝗中酯酶的分类80-81
- 3.3.2 东亚飞蝗不同种群酯酶活性的比较81-82
- 3.3.3 东亚飞蝗酯酶活性的提高与马拉硫磷敏感性的关系82-84
- 第四章 东亚飞蝗不同种群的谷胱甘肽-S-转移酶活性研究84-89
- 4.1 材料和方法84-85
- 4.1.1 供试种群84
- 4.1.2 供试药剂84
- 4.1.3 酶液的制备84
- 4.1.4 谷胱甘肽-S-转移酶活性的测定84-85
- 4.2 结果与分析85-88
- 4.2.1 东亚飞蝗不同体段谷胱甘肽-S-转移酶活性的比较85
- 4.2.2 东亚飞蝗不同种群谷胱甘肽-S-转移酶活性的比较85-88
- 4.3 讨论88-89
- 第五章 东亚飞蝗不同种群乙酰胆碱酯酶特性研究89-109
- 5.1 材料和方法89-94
- 5.1.1 供试种群89
- 5.1.2 供试药剂89-90
- 5.1.3 乙酰胆碱酯酶的纯化90-91
- 5.1.4 乙酰胆碱酯酶活性的测定91-92
- 5.1.5 乙酰胆碱酯酶的专一性抑制92-93
- 5.1.6 乙酰胆碱酯酶动力学常数K_m、V_(max)的测定93
- 5.1.7 乙酰胆碱酯酶体外抑制93-94
- 5.1.8 乙酰胆碱酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳94
- 5.2 结果与分析94-106
- 5.2.1 东亚飞蝗不同体段乙酰胆碱酯酶活性比较94-95
- 5.2.2 乙酰胆碱酯酶纯化效率分析95-96
- 5.2.3 东亚飞蝗中纯化的乙酰胆碱酯酶抑制剂专一性分析96-100
- 5.2.4 东亚飞蝗中纯化的和粗提的乙酰胆碱酯酶动力学100-103
- 5.2.5 乙酰胆碱酯酶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳103
- 5.2.6 东亚飞蝗不同种群乙酰胆碱酯酶对不同抑制剂的敏感性103-106
- 5.3 讨论106-109
- 5.3.1 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的纯化106-107
- 5.3.2 纯化后的乙酰胆碱酯酶的抑制特征107
- 5.3.3 东亚飞蝗乙酰胆碱酯酶的动力学特征107
- 5.3.4 不同东亚飞蝗种群乙酰胆碱酯酶对有机磷抑制剂的敏感性107-109
- 第六章 总结109-113
- 参考文献113-127
- 研究生期间发表的学术论文127-128
- 致谢128
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