收藏本站
《山西大学》 2004年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

工程菌生物转化D-型氨基酸的研究

钮利喜  
【摘要】: 光学活性的D-氨基酸作为一种中间体被广泛应用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊脂、杀虫剂等的合成。非天然D-氨基酸常用生物法或生物-化学法生产。底物5’单替代海因首先由D-海因酶转化为中间物N-氨甲酰-D-氨基酸,然后被N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(DCase)或者化学脱酰胺将其进一步转化为D-氨基酸。目前,工业范围的D-氨基酸生产都采用酶法转化。 按本室从菌株SS-ori中纯化的DCase的N-末端氨基酸序列设计了正向引物,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上设计了简并反向引物。用菌株SS-ori总DNA为模板,经PCR扩增得到一长度约为0.9kb的片段,DNA测序表明基因全长912bp。 将DCase基因分别克窿到pUC18、pET3a、pET32M、pRSET、pGEX4T-2、pExSecI、pMAL-c2X等一系列表达载体中,然后在E.coli DH5α、E.coli 2426、E.coli BL21中进行表达。但大多数表达产物为包涵体而不具酶活性。最终在工程菌E.coli BL21/pMD中获得DCase可溶表达,表达产物为融合蛋白MBP-DCase(77kD),SDS-PAGE光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的20%。经Amylose亲和纯化和Superose 12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X质粒背景,用Factor Xa剪切后,可得约42kD的MBP和35kD的DCase。酶活性检测表明,当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸作为底物,细胞浓度达OD600nm=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸约1.0克。 采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分析了工程菌E.coli EHD-YZⅡ6和天然菌SS-ori转化DL-对羟基苯海因的反应产物,探讨了流动相组份及其比例对分离的影响,结果表明流动相为50mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.2)和甲醇的混合溶液(体积配比为90:10),为最佳洗脱缓冲系统;采用C_(18)拄,在波长254nm检测条件下,有较好分离效果。底物DL-对羟基苯海因(DL-HPH)以及产物N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸(CpHPG)和产物D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,相关系数在0.99以上。用HPLC法既可测定D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的活性,又可对转化产物CpHPG和D-HPG进行了定量分析。 由于N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶极易氧化失活且耐热性较差。因此采用易错聚合酶链式反应(error prone PCR)的方法,对DCase进行定向进化,已获得初步结果,并构建了pET32M-CAT质粒,旨在利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)的高度可溶性对突变文库进行初步的可溶性表达筛选。进一步工作正在进行中。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:TQ922

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王岩;短小芽孢杆菌fadD基因的敲除及其对ω_(-1)-羟基脂肪酸产量的影响[D];宁波大学;2009年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马琼;;魔芋软腐病拮抗菌BJ-1的鉴定[J];安徽农业科学;2008年05期
2 肖春玲;贺晖;廖信军;邹小明;李晓红;;井冈山植物根际土壤微生物的初步研究[J];安徽农业科学;2008年08期
3 朱伟;李娜;;高效氨氮降解菌的筛选·鉴定及降解能力测定[J];安徽农业科学;2008年22期
4 张婷;曲凌云;祝茜;;一株海洋细菌HZBN43的鉴定[J];安徽农业科学;2008年33期
5 董妍玲;谭新国;潘学武;;海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展[J];氨基酸和生物资源;2009年03期
6 董妍玲;唐瑞;潘学武;;一株产D-海因酶菌株的鉴定及离子束诱变选育[J];氨基酸和生物资源;2010年02期
7 施曼玲,邱清波,计翔;两种有鳞类爬行动物消化道微生物的研究[J];动物学杂志;2000年06期
8 史晓霞;师尚礼;杨晶;王正凤;;豆科植物根瘤菌分类研究进展[J];草原与草坪;2006年01期
9 李殿超,蒋引珊,姚爱华,张洪飞;载银沸石的抗菌性能及热稳定性研究[J];非金属矿;2003年03期
10 周丽华;陈士超;邓志瑞;陈沁;郑乐平;刘志学;;太湖沉积物中的可培养细菌:Ⅰ.细菌多样性初步分析[J];湖泊科学;2009年01期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 冯春晖;王娜;张金鸿;王连生;;微生物去除活性污泥中重金属的试验研究[A];第二届全国恶臭污染测试及控制技术研讨会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 莫章桦;产双酶恶臭假单胞菌的选育与酶法制备D-pHPG[D];中南林业科技大学;2007年
2 刘红玉;表面活性剂对水生植物的损伤及生物降解研究[D];湖南农业大学;2001年
3 张春晖;中国优良酒类酒球菌(Oenococcus oeni)的分离筛选及苹果酸—乳酸发酵研究[D];西北农林科技大学;2001年
4 韦萍;D-氨基酸的制备研究[D];南京工业大学;2002年
5 韩继刚;一株新的水稻植物内生固氮细菌Delftia tsuruhatensis HR4的鉴定及其生物学特性[D];首都师范大学;2004年
6 郭春景;微生物肥料及其微生态效应研究[D];东北林业大学;2004年
7 阮文权;好氧颗粒污泥同步硝化反硝化过程研究[D];江南大学;2004年
8 陈世琼;浓缩苹果汁生产过程中嗜酸嗜热菌的分离及相关生物学特性研究[D];中国农业大学;2005年
9 陈宏宇;不同品种和不同茬口大豆根面及根际的微生物群落结构分析[D];中国农业大学;2005年
10 石亚伟;假单胞杆菌YZ26中两种不同类型环酰胺酶的研究[D];山西大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 滕青杉;放线菌次级代谢产物肉桂酰胺的生物合成及菌种鉴定[D];华东理工大学;2011年
2 马英;低能离子注入双酶产生菌Spj0104的诱变选育研究[D];中南林业科技大学;2007年
3 赖珍珍;华南忍冬(山银花)内生菌的初步研究[D];广州中医药大学;2011年
4 刘学禄;养殖场中季铵盐抗性菌株I类整合子特性的研究[D];广东工业大学;2011年
5 蒋春玲;野生大豆根瘤菌Bradyrhizobium sp. GZL13-3的鉴定研究[D];吉林农业大学;2011年
6 林秀;多菌灵降解菌的筛选及其降解特性研究[D];石河子大学;2011年
7 肖佳沐;乐果对土壤微生物菌群结构的影响及降解特性的研究[D];上海交通大学;2011年
8 倪盈盈;乙草胺降解株Y3B-1的分离、鉴定及降解特性研究[D];南京农业大学;2011年
9 张垠;酸模根际产铁载体矿物分解细菌的分离筛选及其与矿物相互作用[D];南京农业大学;2011年
10 孙金金;甲基对硫磷降解菌Sphingopyxis sp.DLP-2的生物学特性及Tnmpd的克隆和功能鉴定[D];南京农业大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨芳;张文红;薛莉;王琰;夏琳;白玉杰;;CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化[J];第四军医大学学报;2007年12期
2 逄晓阳,刘国文,王哲;利用基因工程改造瘤胃微生物调控瘤胃发酵研究进展[J];动物医学进展;2005年07期
3 付小花;高益范;郝思捷;张伯生;任大明;;大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响[J];复旦学报(自然科学版);2007年03期
4 杨文敏,何敏;PCR扩增16s~23srRNA区间序列在细菌检测与鉴定领域的应用[J];广西预防医学;2000年06期
5 高弘;黄英明;刘铭;张剑;华玉涛;曹竹安;;CAT基因敲除对热带假丝酵母产DCA13代谢网络的影响[J];化工学报;2006年09期
6 李志生;羟基脂肪酸的制法与应用[J];湖南化工;1993年01期
7 张信刚,王大璞,杨生荣;二羟基脂肪酸的极压抗磨性能研究[J];摩擦学学报;1998年02期
8 许华夏,李培军,刘宛,宋玉芳;生物细胞色素P450的研究进展[J];农业环境保护;2002年02期
9 周建中;王德良;王忠民;赵丽娟;葛邦国;;采用基因敲除手段降低啤酒酵母蛋白酶A表达的研究[J];酿酒;2006年01期
10 柴伟航,李祖义;诺卡氏菌对油酸的羟基化作用[J];生物工程学报;1995年04期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 张晗星;聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究[D];山东大学;2006年
2 王庆昭;高产琥珀酸大肠杆菌的代谢工程[D];天津大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 刘波;工业酿酒酵母菌株met10基因敲除及其用于工业生产可行性的研究[D];山东大学;2005年
2 高舜晔;细胞色素P450BM3突变体催化羟基化的研究[D];浙江大学;2006年
3 沈珈琦;应用霉菌单加氧酶羟基化齐墩果酸的研究[D];南京工业大学;2006年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;新型高效杀虫工程菌开发成功[J];湖南化工;2000年02期
2 郭丽华;;申请工程菌专利[J];遗传工程;1981年04期
3 赵东峰;任翔;沈丽环;;工程菌发酵培养浅析[J];医药产业资讯;2006年03期
4 王树君;浅析工程菌发酵培养[J];微生物学杂志;2001年01期
5 ;工程菌处理工业污水[J];技术与市场;2000年05期
6 贾振华;马宏;张霞;宋水山;邱健;李承光;;工程菌在无机培养基中共培养生产聚羟基烷酸的研究[J];河北省科学院学报;2006年03期
7 梁颂军;谢水波;王文涛;李仕友;;含重金属抗性基因工程菌的构建与应用[J];铀矿冶;2010年02期
8 李晶,张云湖,赵晓祥,张淑梅,李荣萍,阎淑芳,张凤琴,张季妹;鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究[J];生物技术;1998年06期
9 白福英,赵冰,李亚军,高勇,刘琼;重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌的发酵工艺研究[J];生物技术通讯;2002年04期
10 张丽青;闫艳春;姜红霞;张庆乐;唐心强;;高酯酶活性工程菌的构建及其对有机磷农药的降解[J];工业微生物;2008年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 施巧琴;林峻;郑斌;温建新;翁雪清;黄祥峰;吴松刚;;L-苯丙氨酸FSP-618工程菌的构建[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
2 徐静;寻广新;张青文;周明;杨青芹;;棉花抗虫工程菌在棉株内的动态变化和抗虫稳定性研究[A];新世纪(首届)全国绿色环保农药技术论坛暨产品展示会论文集[C];2002年
3 赵清;刘相梅;詹杨;边疆;刘缨;林建群;颜望明;;高效抗砷喜温硫杆菌工程菌的构建[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
4 韩金祥;王健;;重组变异葡激酶的表达、纯化和鉴定[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
5 薛晓畅;包春杰;韩苇;秦鑫;张存;曹筑荣;李维娜;赵玉红;张英起;;重组人B淋巴细胞刺激因子工程菌高密度发酵[A];2008年中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集[C];2008年
6 何莉;孟冬娅;;重组工程菌pET32a-CR1-SCR15-18/BL21(DE3)[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
7 陈保立;葛鲁娜;王世立;韩金祥;;重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的分批培养[A];山东生物化学与分子生物学会2009年学术会议论文汇编[C];2009年
8 蔡在龙;毛积芳;冯伟华;刘军华;;重组人肝脏再生增强因子工程菌发酵条件的优化研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
9 吴伟斌;施巧琴;郑斌;翁雪清;刘建明;庄秀榕;吴松刚;;L-苯丙氨酸工程菌关键酶基因的分子改造[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
10 孔祥菊;王智;王玉国;冯雁;曹淑桂;;脂肪酶工程菌的构建、表达、纯化及酶学性质的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 本报记者 侯曜禹;利用棉花抗虫工程菌防治棉铃虫[N];农民日报;2001年
2 记者 王伟 通讯员 岳辉;对付害虫又添新的生物武器[N];广东科技报;2000年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 高丽丽;一步单菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸工程菌的构建与优化[D];江南大学;2014年
2 段云霞;产核黄素工程菌B. subtilis PY的代谢工程研究[D];天津大学;2009年
3 钮利喜;工程菌生物转化D-氨基酸及其相关酶的研究[D];山西大学;2007年
4 于金龙;大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成途径的代谢调控研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年
5 何华纲;农业有害微生物的绿色控制方法研究[D];江苏大学;2012年
6 史硕博;应用系统代谢工程方法改进产核黄素枯草芽孢杆菌的研究[D];天津大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 丁岚;产金黄色葡萄球菌肠毒素A工程菌构建及其发酵条件研究[D];华中农业大学;2010年
2 李焕杰;高效脱硫工程菌的构建及其脱硫性能研究[D];中国农业科学院;2009年
3 李攀峰;右旋糖酐蔗糖酶工程菌的稳定性及催化产物果糖的结晶研究[D];合肥工业大学;2013年
4 王朝绚;吡咯喹啉醌工程菌构建及关键基因研究[D];北京化工大学;2013年
5 王萍;秸秆和工程菌联合施用修复铜、镉污染土壤[D];华中农业大学;2011年
6 梁波;重组人白细胞介素-11工程菌的发酵条件研究[D];四川大学;2006年
7 赵云;嗜酸性氧化硫硫杆菌工程菌的构建及其代谢有机质的研究[D];山东大学;2010年
8 吕品;金属硫蛋白基因工程菌的构建及其对重金属响应的研究[D];山西大学;2011年
9 封霞;工程菌生物转化D-型氨基酸的研究[D];山西大学;2004年
10 王思勤;N~α-脱乙酰化重组人胸腺素α1工程菌的构建及表达产物分析[D];吉林大学;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026