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《山西大学》 2006年
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东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素的研究

付月君  
【摘要】:东亚钳蝎(Buthus martrnsii Karsch,BmK)是广泛分布于我国长江以北延伸到蒙古和朝鲜半岛的节肢动物。蝎毒中含有丰富的生理活性物质,其中主要活性成分是多肽(分子量3—9kDa),包括神经毒素和酶。这些活性多肽可选择性的特异结合并调控可兴奋细胞膜上的离子通道。迄今为止,已有近百种神经毒素相继被纯化。根据其分子量大小,它们可被分为长链和短链两大类。长链毒素一般由约60-70个氨基酸组成,含4对二硫键,主要作用于可兴奋细胞膜的Na+通道,由于对长链毒素的认识和研究比较早,其中部分蛋白质一级结构、高级结构、生物药理功能以及基因结构都有较清楚的阐述。短链毒素则由28—40个氨基酸残基组成,含3或4对二硫键,根据结构的同源性,这些小分子多肽又可分成若干类型,它们主要作用于K+或(和)Cl~-通道。2000年,在同一期Toxicon中,中科院生化所和武汉大学两个课题组同时报道了从东亚钳蝎中分离得到一个由35个氨基酸组成、含四对二硫键的多肽,并命名为BmK CT(或Bm-12)。从序列同源性来分析,它与从以色列蝎(Leiurus quinquestriatus)中分离到的氯离子通道毒素有66%的同源性,由于无相关的实验确证其生理活性,暂且认为是类氯离子通道毒素(chlorotoxin-like peptide)。 人脑神经胶质瘤是严重危害人类健康的恶性肿瘤。手术切割虽然是目前主要的治疗手段,但其复发性极强,已成为临床上治疗神经胶质瘤的极大障碍,因此,寻找新型有效的、靶向性防癌、抗癌药物已迫在眉
【关键词】:东亚钳蝎 类氯离子通道神经毒索 性质分析 药理活性
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R99
【目录】:
  • 中文摘要18-25
  • 英文摘要25-34
  • 第一章 文献综述34-60
  • 1 蝎神经毒素概述34-45
  • 1.1 引言34
  • 1.2 蝎神经毒素的性质34-39
  • 1.2.1 一般理化性质34-35
  • 1.2.2 东亚钳蝎毒素的电生理特性35-39
  • 1.3 蝎毒素基因分子生物学研究39-40
  • 1.3.1 蝎毒素cDNA结构及翻译后的加工39
  • 1.3.2 蝎毒素基因组织结构及其mRNA的加工39-40
  • 1.4 蝎神经毒素的结构与功能的研究40-43
  • 1.4.1 长链蝎毒素的结构与功能研究41-43
  • 1.4.2 短链蝎毒素的结构与功能研究43
  • 1.5 蝎神经毒素的基因工程43-45
  • 1.5.1 重组蝎毒素在原核细胞中的表达43-44
  • 1.5.2 重组蝎毒素在真核细胞中的表达44-45
  • 2 电压门控氯离子通道(CLC)的研究进展45-49
  • 2.1 引言45-46
  • 2.2 CLC通道的种类与分布46-47
  • 2.3 CLC通道的特点47-48
  • 2.3.1 拓扑结构47-48
  • 2.3.2 CLC通道的双桶状结构48
  • 2.4 CLC通道的药理学性质48
  • 2.5 与CLC通道相关的疾病48-49
  • 2.6 神经胶质瘤细胞中氯通道的研究49
  • 3 论文的设计思路49-52
  • 3.1 实验背景:蝎氯离子通道毒素及其在治疗人脑神经胶质瘤中的潜在价值49-51
  • 3.2 实验的目的、技术方案流程及创新点51-52
  • 4 参考文献52-60
  • 第二章 利用搭桥PCR法人工优化合成东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素(rBmK CTa)基因及其在大肠杆菌中的分泌表达、纯化与鉴定60-97
  • 1 引言60-61
  • 2 材料与方法61-80
  • 2.1 实验材料61-64
  • 2.2 主要试剂的配制64-67
  • 2.3 实验方法67-80
  • 2.3.1 东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素rBmK CTa全基因合成策略67-73
  • 2.3.2 表达质粒pExSecI-rBmK CTa和pExSecI-Bm-12的构建73-77
  • 2.3.3 rBmK CTa基因的诱导表达及表达量的对比分析77-78
  • 2.3.4 融合ZZ-rBmK CTa蛋白的纯化和切割78-79
  • 2.3.5 rBmK CTa蛋白的Western blot鉴定79-80
  • 3 实验结果80-87
  • 3.1 搭桥PCR法合成东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素rBmK CTa基因80-81
  • 3.2 表达质粒pExSecI-rBmK CTa和pExSecI-Bm-12的构建81-82
  • 3.3 重组菌的诱导表达分析82-83
  • 3.4 分泌融合蛋白的表达与纯化83-85
  • 3.4.1 IgG-Sepharose亲和层析83-84
  • 3.4.2 Superdex75凝胶过滤层析84-85
  • 3.5 羟胺切割重组融合蛋白ZZ—rBmK CTa及其产物分离纯化85
  • 3.6 Western blot分析85-87
  • 3.7 蛋白表达量的分析87
  • 4 讨论87-93
  • 4.1 rBmK CTa基因的合成87-88
  • 4.2 东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素蛋白的序列分析88-90
  • 4.3 rBmK CTa的表达及纯化分析90-92
  • 4.4 羟胺切割条件的分析92-93
  • 5 参考文献93-97
  • 第三章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa的动物急性毒性和细胞毒性分析97-113
  • 1 引言97
  • 2 材料与方法97-102
  • 2.1 实验材料97-98
  • 2.2 实验方法98-102
  • 2.2.1 动物急性毒性实验设计99
  • 2.2.2 细胞毒性实验设计99-102
  • 3 实验结果102-110
  • 3.1 切割后rBmK CTa对小鼠的急性毒性实验和LD_(50)的确定102-104
  • 3.2 Wistar大鼠的乳鼠脑海马区神经胶质细胞的提取和培养104
  • 3.3 预实验结果:纯化后的重组蛋白(ZZ—rBmK CTa)和切割后的rBmK CTa蛋白对正常鼠神经胶质细胞的毒性分析104-107
  • 3.4 人神经胶质瘤细胞株SHG-44的培养107-108
  • 3.5 rBmK CTa蛋白对正常鼠神经胶质细胞和人神经胶质细胞瘤SHG-44毒性的对比分析108
  • 3.6 rBmK CTa蛋白对人白血病细胞株HL-60的毒性作用108-110
  • 4 讨论110-111
  • 4.1 rBmK CTa毒素对人神经胶质细胞瘤SHG-44的毒性与其它蝎毒素细胞毒性的对比分析110
  • 4.2 rBmK CTa毒素在治疗人脑神经胶质瘤中的潜在价值110-111
  • 5 参考文献111-113
  • 第四章 膜片钳技术对东亚钳蝎类氯离子神经毒素(rBmK CTa)电生理学性质的确定113-131
  • 1 引言113-120
  • 1.1 膜片钳技术原理113-114
  • 1.2 膜片钳的记录模式114-115
  • 1.2.1 细胞吸附模式(On-cell mode)115
  • 1.2.2 膜内面向外模式(Inside-out mode)115
  • 1.2.3 全细胞模式(Whole-cell mode)115
  • 1.2.4 膜外面向外模式(Outside-side mode)115
  • 1.3 全细胞记录法基本实验操作115-117
  • 1.4 全细胞记录法的应用117-119
  • 1.4.1 离子通道宏观性质的分析117
  • 1.4.2 离子通道微观性质分析117-118
  • 1.4.3 离子通道的结构分析118
  • 1.4.4 载体运输的性质和机能分析118
  • 1.4.5 细胞内信息传递的分析118
  • 1.4.6 细胞膜电容的测定118-119
  • 1.4.7 对单细胞基因表达的分析119
  • 1.5 全细胞膜片钳记录法的不足119
  • 1.6 采用全细胞膜片钳技术确定东亚钳蝎rBmK CTa蛋白的性质119-120
  • 2 材料与方法120-122
  • 2.1 实验材料120-121
  • 2.1.1 仪器120
  • 2.1.2 所需溶液的配制120-121
  • 2.2 实验方法121-122
  • 2.2.1 电极拉制及电极内液的充灌121
  • 2.2.2 实验参数的设置121
  • 2.2.3 细胞的准备和外理121-122
  • 2.2.4 膜片钳实验122
  • 2.2.5 数据处理122
  • 3 实验结果122-126
  • 3.1 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44氯离子通道的影响122-124
  • 3.2 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44钾离子通道的影响124
  • 3.3 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44钠离子通道的影响124-126
  • 4 讨论126-127
  • 4.1 人神经胶质瘤细胞膜上的氯离子通道126
  • 4.2 rBmK CTa的电生理学性质的确定126-127
  • 5 参考文献127-131
  • 第五章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa的多克隆抗体制备及利用Far Western法探测其在SHG-44上的受体131-148
  • 1 引言131
  • 1.1 抗体概述131
  • 1.2 本章研究的目的和意义131
  • 2 材料与方法131-136
  • 2.1 材料131-133
  • 2.1.1 主要仪器设备131-132
  • 2.1.2 主要试剂132
  • 2.1.3 试剂的配制132-133
  • 2.2 实验方法133-136
  • 2.2.1 抗原的制备133
  • 2.2.2 抗血清的制备133-134
  • 2.2.3 ELISA法检测抗体效价134
  • 2.2.4 东亚钳蝎毒腺总蛋白提取134
  • 2.2.5 东亚钳蝎毒总蛋白提取物的免疫印迹134-135
  • 2.2.6 Far Western法探测rBmK CTa在SHG—44上的受体蛋白135
  • 2.2.7 Pull Down实验获得受体蛋白135
  • 2.2.8 受体蛋白的N-端测序135-136
  • 3 实验结果136-140
  • 3.1 rBmK CTa抗血清的效价检测136
  • 3.2 东亚钳蝎的培养及毒腺总蛋白提取136-138
  • 3.3 东亚钳蝎毒总蛋白提取物的免疫印迹138
  • 3.4 Far Western法探测rBmK CTa在SHG—44上的受体蛋白138-139
  • 3.5 Pull Down实验获得受体蛋白139-140
  • 3.6 受体蛋白的N-端测序140
  • 4 讨论140-147
  • 4.1 rBmK CTa多克隆抗体的特异性140-142
  • 4.2 Far Western方法获得已知蛋白互相作用的未知受体的研究142-143
  • 4.3 蛋白质氨基酸测序的有关要求143
  • 4.4 35 kDa蛋白前6个氨基酸的Blast分析143-147
  • 5 参考文献147-148
  • 第六章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠主要器官的影响148-162
  • 1 引言148
  • 1.1 石蜡切片技术148
  • 1.2 检测rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠各组织器官的影响的意义148
  • 2 材料与方法148-152
  • 2.1 实验材料148-149
  • 2.1.1 实验动物148
  • 2.1.2 实验仪器148-149
  • 2.1.3 主要试剂的配制149
  • 2.2 实验方法149-152
  • 2.2.1 动物的处理149
  • 2.2.2 石蜡切片的制作149-152
  • 3 实验结果152-155
  • 3.1 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肾组织的影响152
  • 3.2 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠大脑组织的影响152
  • 3.3 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠脾脏组织的影响152-153
  • 3.4 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肝脏组织的影响153
  • 3.5 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠腿部骨骼肌肉组织的影响153
  • 3.6 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肺组织的影响153-155
  • 3.7 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠心脏组织的影响155
  • 4 讨论155-159
  • 4.1 东亚钳蝎毒素rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠七种组织器官的影响155-157
  • 4.2 以色列蝎(Leiurus Quinquestriatus)Chlorotoxin的药理学性质研究157
  • 4.3 石蜡切片法与其他技术方法的结合157-159
  • 4.3.1 与免疫学技术结合157-158
  • 4.3.2 石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析158-159
  • 4.3.3 石蜡切片标本是形态计量技术的基础159
  • 5 参考文献159-162
  • 第七章 东亚钳蝎毒素类氯离子通道神经毒素rBmK CTa蛋白的晶体生长条件的初步探索162-177
  • 1 引言162-168
  • 1.1 蛋白质结构测定的主要过程163-164
  • 1.2 蛋白质结晶164-166
  • 1.2.1 蛋白质结晶的原理164
  • 1.2.2 结晶方法和技术164-166
  • 1.3 相位问题166-168
  • 1.3.1 确定相位的主要方法166-168
  • 2 材料与方法168-171
  • 2.1 实验材料168
  • 2.2 实验方法168-171
  • 2.2.1 晶体生长的方法168-169
  • 2.2.2 晶体生长筛选条件的缓冲液配方169-171
  • 3 实验结果171-174
  • 3.1 rBmK CTa结晶条件的摸索171-174
  • 4 结果讨论174
  • 5 参考文献174-177
  • 总结与展望177-181
  • 附录Ⅰ 略语表181-183
  • 附录Ⅱ183-186
  • 一.个人简介183
  • 二.攻读博士学位期间发表的论文183-185
  • 三.主持和参与的科研项目185
  • 四.奖励情况185-186
  • 致谢186-188
  • 承诺书188

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