收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

八肋游仆虫Rab家族新成员Eo-rab-1N基因的克隆、表达及蛋白纯化

李凌燕  
【摘要】:真核细胞中细胞器在空间上分布不同,各细胞器之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递。Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关,在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。纤毛虫是单细胞的原生动物,在进化上属于低等的真核生物,但其各细胞器之间囊泡运输系统极为完善。研究Rab蛋白在单细胞真核生物八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)中的功能对阐明囊泡定向运输机理具有重要意义。 本实验运用PCR、RT-PCR等技术,从八肋游仆虫中克隆到一种新的rab基因。序列分析结果表明:在大核中,该基因全长884bp,除去两端的端粒与非编码区,该基因在大核中由723bp组成。从小核中克隆相应的基因片段,此基因片段序列与大核中序列一致,表明该基因在小核中无内部删除序列的存在。通过RT-PCR,从mRNA获得的该基因的开放读框为663bp,表明该基因在转录过程中有内含子的删除。大核基因序列和cDNA序列比较,发现60bp的内含子序列位于大核基因的153bp-212bp之间,并符合一类内含子GU-AG剪切规则。在遗传密码使用上,该基因内部含有2个TGA,在游仆虫中编码半胱氨酸。同时首次发现,八肋游仆虫基因使用TAG作为终止密码子。NCBI上序列比对表明该基因翻译的蛋白与其它物种Rab1蛋白的同源性达49-52%,因此我们将它命名为Eo-rab-1N。 将从mRNA水平上克隆到的Eo-rab-1N中两个TGA突变为了GC。突变后的Eo-rab-1N构建于原核表达载体pRSETc中。PRSETc-Eo-rab-1N转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导、SDS-PAGE分析及Western-blotting鉴定,目的蛋白获得可溶性表达。分别在诱导温度、诱导时间以及诱导剂浓度水平上对表达条件进行优化。结果表明,加入IPTG使其终浓度为0.1mM,在37℃诱导10小时,目的蛋白获得最大量的可溶性表达。 表达产物经IMAC金属螯合亲和层析、Resource-Q阴离子交换层析及Superdex 75分子筛层析纯化,获得电泳纯的蛋白。Western-blotting分析表明该蛋白为融合有6个His的Eo-rab-1N蛋白。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 许静;李江姣;聂宇;梁爱华;王伟;;游仆虫EoRab2a蛋白的表达、纯化及定位分析[J];水生生物学报;2011年04期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
11 ;[J];;年期
12 ;[J];;年期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 王伟;樊俊蝶;智慧;张志云;柴宝峰;梁爱华;;八肋游仆虫Rab蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
2 柴宝峰;宋莉;郝婵娟;付月君;贺晓静;王伟;李毳;梁爱华;;八肋游仆虫两类肽链释放因子的相互作用[A];中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
3 商慧敏;陈子桂;宋微波;;七种游仆虫核糖体DNA的限制性片段长度多态性(RFLP)分析和系统重建[A];中国原生动物学学会第十一次学术讨论会论文摘要汇编[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 贺晓静;八肋游仆虫中心蛋白的研究[D];山西大学;2005年
2 宋莉;游仆虫第二类肽链释放因子C端功能区解析[D];山西大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李凌燕;八肋游仆虫Rab家族新成员Eo-rab-1N基因的克隆、表达及蛋白纯化[D];山西大学;2006年
2 赵亚琴;定点突变对八肋游仆虫中心蛋白功能及性质的影响[D];山西大学;2004年
3 丰九英;八肋游仆虫中心蛋白的表达、纯化及光谱性质研究[D];山西大学;2003年
4 樊俊蝶;八肋游仆虫rab基因的克隆与表达[D];山西大学;2004年
5 张志云;八肋游仆虫信息素在大肠杆菌中的表达、纯化及其活性测定[D];山西大学;2003年
6 王景涛;八肋游仆虫绿色荧光蛋白(GFP)人工染色体的构建[D];山西大学;2007年
7 智慧;游仆虫囊泡转运相关蛋白Rab-GTPase的基因克隆及功能分析[D];山西大学;2005年
8 聂宇;八肋游仆虫Rab家族基因的多样性及一种非典型Rab蛋白的功能分析[D];山西大学;2008年
9 许静;游仆虫中GARP基因的克隆、表达及光谱分析[D];山西大学;2007年
10 张国强;游仆虫核糖体蛋白L11的功能研究[D];山西大学;2010年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978