胰高血糖素样肽-1突变体基因的克隆、表达与生物学活性分析

贾秀丽

【摘要】： 胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由肠道内分泌细胞——L细胞分泌的葡萄糖依赖性肠降血糖素，在体内有多种存在形式。人体进餐、口服或静脉注射葡萄糖后L细胞被激活，导致GLP-1被迅速释放入血液中。由于GLP-1对调节餐后葡萄糖水平起重要作用，使得GLP-1由一个生理性肠降血糖素成员迅速地转变为一种具有潜力的治疗糖尿病的多肽药物。本课题是在已获得重组人源性GLP-1的基础上进行的后续研究，主要涉及GLP-1的生物活性分析和GLP-1突变体基因的克隆、表达及表达产物的纯化，并探索纯化获得的GLP-1突变体的生物学活性。本研究结果不仅可为产业化规模制备GLP-1突变体提供技术路线，而且也为开发GLP-1的临床应用提供资料。课题研究的主要内容包括：(1)重组GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)体内生物学活性分析；(2)GLP-1(7-37)突变体基因的克隆及表达载体的构建；(3)GLP-1(7-37)突变体的分离纯化；(4)GLP-1(7-37)突变体的生物学活性分析。方法： 1．正常SD大鼠按18mmol／kg腹腔注射50％葡萄糖，诱发暂时性高血糖动物模型。腹腔注射不同剂量(2μg／100g、4pμg／100g、8μg／100g)GLP-1(7-36)NH_2和GLP-1(7-37)，间隔取血测定血糖与血浆胰岛素水平。正常SD大鼠按60mg／kg腹腔注射链脲佐菌素，建立实验性1型糖尿病大鼠模型。静脉输注GLP-1(7-36)NH_2(1～1.2pmol／kg·min)120min并观察血糖变化。 2．在上述研究基础上，利用定点突变技术改造GLP-1(7-37)基因，将其第2位丙氨酸(Ala)密码子突变为甘氨酸(Gly)密码子(~2Ala→~2Gly)。PCR扩增GLP-1突变体基因~2Gly-GLP-1(7-37)，经酶切克隆于pGEM-7Z(+)载体中，构建pGEM-7Z(+)／~2GIy-GLP-1(7-37)克隆载体，双酶切鉴定后把~2Gly-GLP-1(7-37)基因定向插入pGEX-4T-3多克隆位点，构建pGEX-4T一3／~2Gly-GLP-1(7-37)融合表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。 3．诱导表达的菌体超声破碎后，裂解液用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化，纯化的融合蛋白再经CNBr裂解、Sephadex G-25柱脱盐、QAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和RP-C_(18)柱脱盐，得到重组突变体蛋白~2Gly-GLP-1(7-37)。重组突变体蛋白进一步用Western印迹分析。 4．将重组GLP-1(7-37)和~2GIy-GLP-1(7-37)分别与二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidylpeptidaseⅣ，DPPⅣ)在37℃共同孵育，于不同时间取样，HPLC分析GLP-1(7-37)和~2Gly-GLP-1(7-37)抗DPPⅣ活性。之后将二者分别以4μg／100g剂量腹腔注射SD大鼠，在不同时间点取血，测定血糖与血浆胰岛素水平。结果与讨论： 1．腹腔注射4μg／100g、8μg／100g GLP-1(7-36)NH_2和GLP-1(7-37)，处理组大鼠的血糖、血浆胰岛素水平与对照组之间的差别具有非常显著性意义(P＜0.001)，且呈现一定的量效关系；二者之间促胰岛素分泌和降血糖活性差异无显著性。静脉输注GLP-1(7-36)NH_2 60min后，血糖水平(17.04±1.31)mmol／L(P＜0.05)，120min后血糖水平(11.98±1.05)mmol／L(P＜0.001)。实验结果提示：GLP-1不仅对2型糖尿病，而且对1型糖尿病也具有潜在治疗作用。 2．经双酶切鉴定和测序分析，证明~2Gly-GLP-1(7-37)基因已克隆到pGEX-4T-3载体中。SDS-PAGE和凝胶扫描分析，融合蛋白以可溶形式存在，其表达量占菌体总蛋白的23.5％。 3．裂解液用Glutathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后得到GST-~2Gly-GLP-1(7-37)融合蛋白，融合蛋白经CNBr裂解、Sephadex G-25柱脱盐、QAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析和RP-C_(18)柱脱盐，得到纯度大于98％的重组~2Gly-GLP-1(7-37)。Western印迹分析证实，该突变体可被特异性GLP-1抗体所识别。 4．与DPPⅣ孵育4h后，大于90％的GLP-1(7-37)被DPPⅣ降解，而85％以上的~2Gly-GLP-1(7-37)保持完整，可明显抵抗DPPⅣ的降解。与对照组相比，腹腔注射重组GLP-1(7-37)和~2Gly-GLP-1(7-37)(4μg／100g)可显著降低血浆葡萄糖水平，并提高血浆胰岛素水平(P＜0.001)，且在15、30min时间点~2Gly-GLP-1(7-37)的效应高于GLP-1(7-37)(P＜0.05)。实验结果表明，第二位发生突变的~2Gly-GLP-1(7-37)在体外可抵抗DPPⅣ的降解，在大鼠体内具有降血糖活性与促胰岛素分泌功能。

【关键词】：胰高血糖素样肽-1 定点突变 融合表达 层析 生物活性
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：Q78
【目录】：

摘要6-8
ABSTRACT8-11
第一部分文献综述11-15
1.1 GLP-1的结构与功能11-13
1.2 GLP-1的生物活性13
1.3 GLP-1结构改造概况13-14
1.4 GLP-1前景展望14-15
第二部分重组GLP-1(7-36)NH_2和GLP-1(7-37)体内生物学活性分析15-22
2.1 实验材料15
2.2 实验方法15-17
2.3 结果17-20
2.4 讨论20-22
第三部分 GLP-1(7-37)突变体基因的克隆及表达载体的构建22-31
3.1 实验材料22-23
3.2 实验方法23-28
3.3 结果28-30
3.4 讨论30-31
第四部分 GLP-1(7-37)突变体的分离纯化31-36
4.1 实验材料31
4.2 实验方法31-32
4.3 结果32-35
4.4 讨论35-36
第五部分 GLP-1突变体的生物学活性分析36-41
5.1 实验材料36
5.2 实验方法36-37
5.3 结果与讨论37-41
第六部分结论41-44
参考文献44-46
附录46-47
致谢47-48

下载全文更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

	【相似文献】
	【相似文献】

中国期刊全文数据库

前10条

1	曾琦锴;杜红丽;翟志臣;林小琼;林影;;Lysine 21突变对树干毕赤氏酵母木糖还原酶辅酶依赖性的影响[J];生物工程学报;2008年06期
2	郭冬林，唐伟，江雪源，徐贤秀;第20位脯氨酸对人肿瘤坏死因子的活性和结构的作用[J];生物化学与生物物理学报;1994年04期
3	张浩,毛秉智,王全立,冯起,杜芝燕,刘晓达;PCR定点突变血红蛋白基因的克隆和筛选[J];生物学杂志;1999年06期
4	苏智广,张思仲,夏庆杰,肖翠英;脂蛋白脂酶基因的克隆、序列测定及定点突变[J];中国生物化学与分子生物学报;2001年06期
5	王宇新;杨志新;朱恒奇;周晓巍;黄培堂;;IL-1ra突变体的构建、表达及初步的药代动力学分析[J];生物工程学报;2006年03期
6	郭小兵;张志坚;张钦宪;;PCR介导的ret基因体外定点突变[J];郑州大学学报(医学版);2007年01期
7	谷维娜;杨培龙;王亚茹;罗会颖;孟昆;伍宁丰;姚斌;范云六;;Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究[J];生物工程学报;2007年02期
8	姚庆荣;郭运玲;孔华;张金文;郭安平;贺立卡;刘恩平;;大肠杆菌glgC基因的定点突变及高效表达[J];热带作物学报;2007年01期
9	王青艳;陈发忠;黄福宝;韦传东;韦宇拓;黄日波;;Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究[J];广西农业生物科学;2007年02期
10	李景;冉雪琴;王嘉福;;贵州香猪生长激素cDNA的克隆及原核表达[J];贵州畜牧兽医;2007年06期

中国重要会议论文全文数据库

前10条

1	杜红丽;王靖方;魏冬青;林影;;热带假丝酵母木糖醇脱氢酶定点突变设计的生物信息学分析[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
2	赵晗;卢丽丽;范树泉;肖敏;;短双歧杆菌α-半乳糖苷酶Aga2催化位点定点突变研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
3	牛静宜;王晔;陈鹏;王宜强;;重叠区扩增基因拼接法定点突变TGFBI及其真核表达载体的构建[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
4	王玉炯;许崇波;曾瑾;马春燕;李芳;;产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变[A];科技、工程与经济社会协调发展——中国科协第五届青年学术年会论文集[C];2004年
5	柳广飞;周集体;王竞;吕红;金若非;;偶氮还原酶AZR的结构与定点突变研究[A];第十次全国环境微生物学术研讨会论文摘要集[C];2007年
6	牛聪伟;孙璐;张楠;席真;;双点突变乙酰羟基酸合成酶(AHAS)的基因表达及其酶与除草剂的相互作用[A];第五届全国化学生物学学术会议论文摘要集[C];2007年
7	迟灵芝;刘茂军;冯志新;单虎;邵国青;;猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年
8	单虎;秦晓冰;黄娟;张莉平;迟灵芝;;猪肺炎支原体P46基因的克隆及表达[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年
9	张士虎;苗毅;;胃旁路术对糖尿病大鼠的降糖作用及其机制探讨[A];中华医学会第十一届全国胰腺外科学术研讨会论文汇编[C];2006年
10	王建林;陈思礼;赵开弘;;集胞藻PCC 6803 apcD基因的定点突变及体内重组研究[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库

前3条

1	何国庆张灏;新酶种的开发和酶性能的改善(下)[N];中国食品报;2009年
2	本报记者赵笛;沙珍霞：揭开鱼类基因之谜[N];青岛日报;2011年
3	记者杨金志;我国科学家揭示药物治疗牛皮癣的分子基础[N];经济参考报;2009年

中国博士学位论文全文数据库

前10条

1	周波;枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D];山东农业大学;2011年
2	杨建强;革耳（Panus rudis）漆酶的异源表达和酶学性质改良[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
3	高平挥;白念珠菌多药耐药蛋白Cdr1p构效关系研究[D];第二军医大学;2006年
4	李艳;嗜麦芽窄食单胞菌L1、L2两种β内酰胺酶研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
5	董慧;叶绿体ATP合酶的活性调节与亚基的定点突变[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2005年
6	郭勤;海参精氨酸激酶的折叠与结构研究[D];清华大学;2005年
7	张桂荣;嗜热酯酶APE1547的立体选择性研究[D];吉林大学;2006年
8	吴毓;核糖核酸酶抑制因子的基因修饰对其活性的影响[D];大连医科大学;2004年
9	潘超;甘氨酸受体在ATP耗竭细胞保护中的作用及机制研究[D];南京医科大学;2005年
10	宋水川;高效、低毒免疫毒素SM5-1-PE38KDEL（突变体）的构建及其抗肿瘤作用机理的研究[D];第二军医大学;2005年

中国硕士学位论文全文数据库

前10条

1	杨欣;深海细菌Geobacillus stearothermophilus TH10中嗜热脂肪酶的表达鉴定及体外诱变研究[D];厦门大学;2009年
2	杨登峰;新型甘油脱水酶同源基因的克隆、表达及其理性设计[D];广西大学;2005年
3	管海宏;天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的多反应性鉴定及其分子机制的初步探讨[D];第四军医大学;2005年
4	陈木妹;扩展青霉脂肪酶的定点突变[D];福建师范大学;2005年
5	吴倩倩;琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究[D];中国海洋大学;2008年
6	肖志广;鸡Mx基因的克隆及其抗AIV活性的研究[D];中国农业科学院;2011年
7	陈国仁;扩展青霉脂肪酶的定点突变及随机突变[D];福建师范大学;2005年
8	郭娟娟;B10位突变对提高重组人胰岛素基因在糖尿病大鼠体内表达效率的研究[D];中国医科大学;2006年
9	李晨;一种重组荞麦胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性[D];山西大学;2006年
10	张洪喜;纤维素酶的定向进化、定点诱变及耐碱机理研究[D];山东大学;2007年

	快捷付款方式		订购知网充值卡	订购热线	帮助中心
	银行卡支付宝神州行	知网卡手机短信更多>>	免费送卡上门银行汇款购卡邮局汇款购卡	400-819-9993 010-62791813 010-62985026	常见问题在线咨询阅读器下载	广告服务知网卡新手指南