八肋游仆虫绿色荧光蛋白（GFP）人工染色体的构建

【摘要】： 原生动物是区别于原核生物和高等真核生物的一个特定类群。它们作为一类单细胞真核生物，具有许多独特的特征，诸如，密码子使用的特殊性、单基因染色体结构和多核现象等，是分子细胞生物学研究的理想材料和模式生物。八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)是下毛目(Hypotrichida)游仆科(Euplotidae)的一个具有代表性的种。其具有一个无转录活性的生殖核(小核)，负责有性生殖过程中遗传物质的传递；一个具转录活性的营养核(大核)负责细胞营养生长过程中基因的表达。 下毛类纤毛虫的大核染色体被称为“基因大小染色体(gene-size chromosome)”，其含有一个基因编码序列，5′和3′端各有一段基因表达调控序列以及端粒序列(C_4)_4(A_4)_3，是真核生物中结构最简约染色体。这一特征是研究染色体结构和功能的一个优势，是本研究构建纤毛虫人工染色体，分析基因功能的基础。 本研究首先克隆了八肋游仆虫的β_2-微管蛋白新基因(DQ864704)，与β_1-微管蛋白基因相比，基因编码区(1335bp)的同源性达到99.1％。基因的非编码区(即上下游调控序列)的差异较大，但上游调控序列中均有一个TATAA盒，而且均富含AT。我们利用β_2-微管蛋白基因的上下游调控序列，构建纤毛虫大核人工染色体EUAMC，该染色体包括八肋游仆虫β_2-微管蛋白基因的上下游基因表达调控序列和端粒序列；动物绿色荧光质粒pEGFP-N_1(Clontech)的质粒元件-GFP基因、多克隆位点和抗生素基因(Kan~r)等。GFP基因将作为标记基因置于β_2-微管蛋白基因上下游调控序列之间。为了使GFP基因在八肋游仆虫中得到高效表达，用点突变的方法对该基因进行了密码子优化，便于原生动物细胞定位与基因功能的分析。用优化的脂质体转化方法将含有人工染色体的重组质粒pBTub-tel2转化到处于有性生殖分裂间期阶段的游仆虫细胞中，结果表明，GFP基因在游仆虫细胞中得以高效表达，36-48小时绿色荧光均匀分布在细胞核周围，逐渐扩散到整个细胞，染色体能够在大核中保持约90小时。