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《山西大学》 2008年
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东亚钳蝎昆虫毒素BmK IT的表达、纯化以及性质研究

许成钢  
【摘要】: 蝎是一种以体软昆虫为食的动物,在长期的进化过程中为生存或防卫的需要在其体内产生了一系列毒素蛋白。这些活性多肽可选择性地特异结合并调控可兴奋细胞膜上的离子通道。它作为十分有价值的探针被广泛应用于相关靶离子通道分子调控机理的研究。同时,蝎毒素是研究蛋白质结构和功能关系的极好模型。其中,蝎昆虫神经毒素(insect-selective scorpion neurotoxin)能够专一作用于昆虫而对哺乳动物无害或毒性很小,因此可利用此类昆虫特异性的蝎神经毒素开发新型生物杀虫剂和开展抗虫害转基因植物的研究。 本课题组从主要分布于我国的东亚钳蝎(Buthus martrnsii Karsch,BmK)中克隆到了一种兴奋型昆虫毒素基因(BmK IT)。该毒素蛋白含有69个氨基酸残基和4对二硫键。本研究将BmK IT进行原核可溶性表达,并通过缓冲液的优化、Intein自剪切、蛋白质氧化重折叠等一系列方法获得了大量的重组BmK IT,同时对利用大肠杆菌二硫键异构酶DsbC催化BmK IT折叠进行了初步研究。通过虫试实验、全细胞膜片钳检测、圆二色谱和结晶学等方法对其生理生化学性质进行深入研究,获得以下主要结果: 1、东亚钳蝎昆虫神经毒素的可溶性表达、纯化。将BmK IT的C端融合6个组氨酸残基,通过pTWIN1表达系统获得了Intein-BmK IT-his_6融合蛋白,该融合蛋白N端为有助溶作用的Intein,C端为纯化标签His_6。通过在Ni-NTA亲和柱上诱导Intein自剪切后洗脱得到相对纯的BmK IT,其中含有少量未剪切的融合蛋白。Superdex 75凝胶过滤层析时发现,目的蛋白主要以多聚体的形式存在,少量为单体。我们将收集的单体进行BmK IT虫试实验,1.0和2.0nmol/g BmK IT-his_6的实验组的半致死时间LT50分别为67±1h和47±1h,表明其具有良好的生物学活性。 2、重组东亚钳蝎昆虫毒素的氧化折叠。在DnaB-IT融合蛋白中的Intein DnaB部分是具有生物活性的,它们能够在pH 6.5时有效地进行自剪切,但释放的BmK IT快速聚合沉淀。对DnaB-IT融合蛋白的游离巯基进行测定,发现大多数二硫键是在体外蛋白纯化过程中形成的。因此,在E.coli中表达的目的蛋白处于未折叠的状态,二硫键没有完全形成,形成了“可溶性的包涵体”,它含有正确折叠的融合蛋白DnaB和未折叠或折叠错误的目的蛋白IT。随后,在优化的条件下,我们对重组BmK IT蛋白进行氧化重折叠,结果显示,目的蛋白在柱上有效地进行重折叠,目的蛋白主要以单体的形式存在。纯化的BmK IT具有很高的热稳定性,在100℃下仍保持可溶。因此,我们设计了一个简单而有效的BmK IT纯化方法。表达的上清液首先进行IMAC(immobilized metal ion affinity chromatograpby),洗涤杂蛋白后对目的蛋白进行氧化折叠,然后柱上诱导Intein自剪切,最后洗脱下的目的蛋白经过80℃水浴20min,离心获得纯的BmK IT。最终250ml培养液中能够得到1.5mg的目的蛋白。 3、二硫键异构酶DsbC催化下的BmK IT氧化折叠。从大肠杆菌中克隆了二硫键异构酶DsbC,构建了重组表达质粒pRSETc-DsbC,获得了大量可溶的DsbC,实验结果显示,重组蛋白His_6-DsbC以二聚体的形式存在,并且具有氧化还原活性和二硫键异构酶活性。对DsbC在体外和体内催化富含二硫键的蝎昆虫毒素BmK IT的氧化折叠进行了初步研究。结果表明,rDsbC能够加快BmK IT的折叠速度,但是需进一步对BmK IT和rDsbC的比例进行优化。体内将BmK IT与DsbC共表达实验,目前尚未获得预期效果,大量rIT仍然被吸附在柱材料中,共表达体系有待进一步改进。 4、对棉铃虫幼虫神经细胞的急性分离与体外培养条件进行摸索,为下一步利用全细胞膜片钳技术对重组BmK IT作用于棉铃虫幼虫神经细胞的电压门控钠离子通道的电生理学活性分析奠定了基础。 5、东亚钳蝎神经毒素BmK IT蛋白的晶体生长条件的初步探索。使用HamptonResearch公司的晶体生长试剂盒(Crystal Screening Kit)中的46个条件进行晶体生长条件的初步筛选,蛋白浓度为5mg/mL,于室温放置,在6号条件(0.1mol/LTris-HCl,pH 8.5,0.2mol/L柠檬酸三钠,30%v/v聚乙二醇400)中筛选到三角锥形晶体,并确定该条件为稳定的、可重复的最佳结晶条件,为BmK IT结构的解析提供了条件。
【关键词】:东亚钳蝎 兴奋性昆虫神经毒素 氧化重折叠 性质分析
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78
【目录】:
  • 中文摘要13-15
  • ABSTRACT15-18
  • 第一章 文献综述18-41
  • §1 引言18
  • §2 蝎昆虫神经毒素的种类18-20
  • 2.1 蝎神经毒素的分类18-19
  • 2.2 蝎昆虫神经毒素的分类19
  • 2.3 已知蝎昆虫神经毒素的种类19-20
  • §3 蝎昆虫毒素基因分子生物学研究20-23
  • 3.1 蝎毒素基因组织结构及其mRNA的加工20-22
  • 3.2 蝎毒素cDNA结构及翻译后的加工22-23
  • §4 蝎昆虫神经毒素的结构研究23-26
  • 4.1 兴奋型蝎昆虫神经毒素与哺乳动物毒素结构比较23-24
  • 4.2 兴奋型蝎昆虫神经毒素的结构特点24-26
  • §5 蝎昆虫神经毒素的生物活性测定26-29
  • 5.1 毒理学方法26-27
  • 5.2 电生理学方法27-29
  • 5.3 竞争结合试验29
  • §6 国内外重组蝎昆虫神经毒素的研究进展29-31
  • 6.1 重组蝎昆虫毒素在原核细胞中的表达30
  • 6.2 重组蝎毒素在真核细胞中的表达30-31
  • §7 蝎昆虫神经毒素在农业害虫防治中的应用31-33
  • 7.1 重组杆状病毒31-32
  • 7.2 培育转基因抗虫植物32-33
  • §8 参考文献33-41
  • 第二章 东亚钳蝎昆虫神经毒素的可溶性表达、纯化41-64
  • §1 引言41-44
  • 1.1 蛋白内含肽(intein)41
  • 1.2 蛋白质的剪接机制41-42
  • 1.3 蛋白质剪接的应用42-44
  • §2 材料和方法44-52
  • 2.1 实验材料44-47
  • 2.2 实验方法47-52
  • §3 实验结果52-60
  • 3.1 表达载体的构建52-53
  • 3.2 重组蛋白的表达53-54
  • 3.3 Intein自剪切条件的优化54-55
  • 3.4 缓冲液的优化55-57
  • 3.5 BmK IT重组蛋白的纯化57-59
  • 3.6 BmK IT-His_6 CD光谱59-60
  • 3.7 BmK IT-His_6活性分析60
  • §4 讨论60-61
  • §6 参考文献61-64
  • 第三章 重组东亚钳蝎昆虫毒素的氧化折叠64-80
  • §1 引言64-66
  • §2 材料和方法66-68
  • 2.1 实验材料66-67
  • 2.2 实验方法67-68
  • §3 结果68-76
  • 3.1 两种BmK IT融合蛋白纯化行为的比较68-70
  • 3.2 两种BmK IT融合蛋白稳定性比较70-71
  • 3.3 重组蛋白二硫键的测定71-72
  • 3.4 重组BmK IT的氧化折叠72-75
  • 3.5 重组BmK IT的热稳定性分析75-76
  • §4 讨论76-78
  • §5 参考文献78-80
  • 第四章 二硫键异构酶DsbC催化下的BmK IT氧化折叠80-98
  • §1 引言80-81
  • §2 材料和方法81-86
  • 2.1 实验材料81-82
  • 2.2 实验方法82-86
  • §3 实验结果86-95
  • 3.1 DsbC基因的克隆86
  • 3.2 DsbC表达载体的构建86-88
  • 3.3 DsbC的诱导表达88-89
  • 3.4 rDsbC的纯化89-91
  • 3.5 Western Blot鉴定91
  • 3.6 rDsbC的氧化还原状态分析91-92
  • 3.7 DsbC催化蛋白折叠活性92-93
  • 3.8 rDsbC催化BmK IT氧化折叠初步研究93-94
  • 3.9 BmK IT与DsbC共表达94-95
  • §4 讨论95
  • §5 参考文献95-98
  • 第五章 rBmK IT电生理学活性检测的准备工作——棉铃虫神经细胞的提取98-108
  • §1 引言98-101
  • 1.1 膜片钳技术98-99
  • 1.2 膜片钳技术的应用99-100
  • 1.3 膜片钳技术应用于杀虫剂作用机理的研究100-101
  • §2 材料与方法101-102
  • 2.1 实验材料101
  • 2.2 实验方法101-102
  • §3 实验结果102-105
  • 3.1 棉铃虫腹神经索的提取102-103
  • 3.2 棉铃虫神经细胞的观察103-104
  • 3.3 棉铃虫神经细胞的分离培养104-105
  • §4 讨论105-106
  • §5 参考文献106-108
  • 第六章 东亚钳蝎神经毒素rBmK IT蛋白的晶体生长条件的初步探索108-120
  • §1 引言108-111
  • 1.1 蛋白质结晶的基本过程108-109
  • 1.2 结晶方法109
  • 1.3 蛋白质结晶的影响因素109-111
  • §2 材料与方法111-115
  • 2.1 实验材料111
  • 2.2 实验方法111-115
  • §3 实验结果115-117
  • 结晶条件的摸索115-117
  • §4 结果讨论117
  • §5 参考文献117-120
  • 总结与展望120-123
  • 总结120-122
  • 展望122-123
  • 附录Ⅰ123-125
  • 附录Ⅱ125-129
  • 附录Ⅲ129-131
  • 致谢131-132

【参考文献】
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6 刘雁;形态之“动”研究[D];福建师范大学;2005年
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8 林恒先;产木聚糖酶新菌种的筛选、鉴定及酶的纯化和性质分析[D];暨南大学;2006年
9 魏晓星;葡萄穗霉(Stachybotrys sp.)的分离鉴定及其β-葡萄糖苷酶的性质分析[D];中国农业大学;2005年
10 吕猛;东亚钳蝎毒素BmαTX14的基因组克隆、真核表达纯化及其功能的初步研究[D];武汉大学;2005年
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