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《山西大学》 2010年
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苦荞过敏原TBa的定点突变及免疫活性研究

任晓霞  
【摘要】: 荞麦作为一种健康保健食品,种子中含有丰富的蛋白,氨基酸,芸香苷和黄酮醇,具有抗高血压和血管出血的功效。由于它通常可使部分接触或食用的人发生严重的过敏反应,并且临床症状多样,这就极大的限制了其作为一种新型保健食品和食品添加剂的使用范围。荞麦过敏原蛋白分子和其过敏机制的研究对于荞麦过敏症的精确诊断和安全治疗至关重要且刻不容缓。 我们先前的工作分离纯化得到云南苦荞中一种分子量大小为24kDa的过敏蛋白(TBa),经过各种免疫活性检测发现它是荞麦中的一种主要过敏原。通过分子克隆,首次得到了TBa的核苷酸序列,并在GenBank进行了登陆(登录号:AY044918)。本研究通过抗原表位软件预测,将TBa全长氨基酸序列划分为六个表位区段:E1:27-67,E2:87-137,E12:27-137,E3:120-156,E6:155-191,E36:120-191。经检测,E1与荞麦过敏症患者血清结合能力最强,说明E1可能是其中的主要表位。 在NCBI网站上用BLAST软件对TBa和其他一些已知蛋白质的氨基酸序列进行分析发现,TBa中20-160位(主要表位E1的第27-67位)氨基酸区域属于cupin超家族,此区域是这一家族的特征序列。在此基础上,使用DNAStar软件将E1的序列和同源性较高的其他植物种子贮藏蛋白进行比对,结果显示39,42,47和54的亮氨酸高度保守,并且二级结构预测也表明这几个位点的氨基酸处于柔性较好的区域。 进一步将E1进行定点突变,用精氨酸取代39,42,47,54的亮氨酸和52位的缬氨酸,并分别命名为L39R,L42R,L47R,V52R和L54R。将突变体基因与表达载体pET-32m连接,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。Ni2+-NTA亲和纯化后,SDS-PAGE检测表明突变体的分子量与E1一致,纯度达到95%以上。采用ELISA和点杂交的方法检测重组蛋白与过敏症患者及健康者血清的IgE结合活性。结果表明五个突变体的免疫活性都有所降低,其中L42R,L47R和L54R的活性降低了约50%。说明TBa分子中的42,47,54位的亮氨酸对其致过敏性起着重要作用,本文不仅确定了TBa过敏原分子中的关键氨基酸,而且也为探讨荞麦过敏原的致敏机理及应用研究奠定了研究基础。
【学位授予单位】:山西大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S517

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