收藏本站
《太原理工大学》 2013年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

金纹细蛾I型几丁质酶的表达、纯化及酶学活性测定

仙笑笑  
【摘要】:几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖残基通过β-1,4糖苷键结合而成的直链多聚物,是昆虫外骨骼、肠道、气管及围食膜等的主要组成成分。昆虫几丁质酶是一种能够将几丁质水解成为寡聚物的内切酶,广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中,在昆虫的生长发育过程中精确的调节着几丁质的代谢。目前,昆虫几丁质酶主要应用在病虫害防治、疾病控制及几丁质生物垃圾的降解等方面。 本研究首次将金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶(LrCHT5)基因分别构建到原核表达载体pRSET-C、pET28a、pET32a及pMAL-s上,进行原核载体的筛选,期望能够获得表达可溶性蛋白的载体。利用分子生物学常规实验方法构建重组载体,将其分别转化到相应的表达感受态中,利用IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析结果表明构建的重组BL-pET28a-LrCHT5及BL-pET32a-Lr CHT5表达的蛋白以包涵体形式存在,重组BL-pRSET-LrCHT5没有表达出目的蛋白,重组BL-pMAL-ZrCHT5表达出110kDa左右的可溶性融合蛋白MBP-Lr CHT5。Western blot检测结果进一步证明重组BL-pMAL-LrCHT5菌表达出可溶性融合蛋白。为了使融合蛋白能够高效表达,本研究对重组pMAL-LrCHT5菌液的表达条件进行优化,最佳表达条件最终优化为菌液OD值为0.778,诱导剂IPTG浓度为0.5mmol/L,诱导的过程中采用16℃过夜诱导。对于表达的MBP-LrCHT5蛋白采用4℃与Amylose柱过夜结合进行纯化,SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化出纯度较高的MBP-LrCHT5融合蛋白。利用胶状几丁质及4MU-(GlcNAc)3作为底物均未检测到活性。 由于重组BL-PMAL-LrCHT5表达的融合蛋白MBP-LrCHT5在纯化的过程中及生物学活性方面存在问题,本研究将LrCHT5基因构建到载体pFastBacTM Dual上,进一步转化入DH10Bac感受态中,获得重组穿梭载体Bacmid-LrCHT5,利用脂质体介导转染Sf9细胞并进行细胞表达。由于LrCHT5本身含有信号肽区,所以在表达的过程中分泌到细胞培养液中。表达结束后,对培养液进行收集透析,利用Ni-NTA柱进行蛋白分离纯化,SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化得到单一条带的纯化蛋白。 本研究对原核和Sf9细胞表达的目的蛋白进行酶学活性检测。利用4MU-(GlcNAc)3作为底物,结果显示,原核表达的融合蛋白不具酶学活性,Sf9细胞表达的目的蛋白的比活力为2.917U/μg,最佳温度为50℃左右,最佳pH为6.0。高浓度的金属离子Mn2+、Ca2+、Mg2+及Ba2+对LrCHT5蛋白具有不同程度的促进作用,Cu2+对酶有较强的抑制作用,SDS酶的抑制作用最强。通过对LrCHT5蛋白的动力学参数测定结果显示Km为14.2μm/L, Vmax值为0.905μM/min。另外,对纯化的LrCHT5蛋白进行抑菌实验研究,结果表明LrCHT5蛋白对青霉及酵母分别存在不同程度的抑制作用。本课题深入研究了LrCHT5的生化性质,为LrCHT5功能研究奠定了基础,同时为金纹细蛾的生物学防治提供理论依据。
【学位授予单位】:太原理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S433

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙瑞红,窦立志,张玉涛;苹果金纹细蛾发生及防治研究进展[J];北方果树;2001年01期
2 张志云,张虎生,孙毅,梁爱华;双价抗虫基因植物表达载体的构建[J];西北植物学报;2004年08期
3 谢雅明;可溶性甲壳质的制造和用途[J];化学世界;1983年04期
4 李娟;戴桂馥;王少敏;刘宏民;;ESI-MS测定牛血清白蛋白分子量过程中的pH影响[J];化学研究;2007年02期
5 刘明艳;张洪斌;胡雪芹;魏青丽;;昆虫来源的几丁质酶的分离纯化及酶学性质[J];生物工程学报;2010年03期
6 苏畅 ,夏文水 ,姚惠源;氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的测定方法[J];食品工业科技;2003年06期
7 王芳,顾奇伟,武家才,张传溪;HaSNPV几丁质酶基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达及其产物对Bt杀虫剂的增效作用[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年06期
8 肖业臣,罗晓斌,冯佩富,钟仰进,曹阳;昆虫几丁质酶的研究进展[J];生物技术;2003年01期
9 史鹏;张学尧;王丽丽;石亚伟;;环亚酰胺水解酶在大肠杆菌中的重组表达与纯化[J];山西大学学报(自然科学版);2008年02期
10 陈新锋;杨旭英;吕建坤;胡作栋;;金纹细蛾发生规律与综合防治技术[J];西北园艺(果树);2010年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 许惠英;天然高分子化合物壳聚糖的制备及应用[J];安徽化工;2001年01期
2 邢东阳,夏彩芬,陈炳稔;甲壳素/壳聚糖及其衍生物的制备和吸附特性研究进展[J];安徽化工;2004年03期
3 程猷;薛健;王建明;黄晓会;庞作正;薛雯;;重金属去除方法在中药中的应用[J];安徽农业科学;2011年09期
4 陈乃富,刘文中,闵运江;克氏螯虾虾壳制备氨基葡萄糖盐酸盐的工艺研究[J];氨基酸和生物资源;2002年03期
5 田强强;徐利;谭黎霞;王敦;李厚华;;双价抗病虫基因植物表达载体Lc-ChiA-pBI121的构建[J];北方园艺;2011年11期
6 程红霞;林强;;壳聚糖对中药水提液中重金属残留的吸附特性研究[J];北京联合大学学报(自然科学版);2006年01期
7 李慧;严善春;曹传旺;李奇;;呋喃虫酰肼对舞毒蛾生长发育和保护酶活性的影响[J];北京林业大学学报;2012年02期
8 张延坤,刘国忠;甲壳素与壳聚糖及其衍生物的制备和在日化工业中的应用[J];日用化学工业;1998年04期
9 刘长霞;甲壳素脱乙酰化反应动力学规律评述[J];沧州师范专科学校学报;2002年03期
10 冀宪领,盖英萍,牟志美,李卫国,张作法;低聚壳聚糖对桑树种子萌发和桑树生理特性影响的研究[J];蚕业科学;2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 魏巍;贺淹才;刘爱花;;几丁质酶酶活测定方法的研究进展[A];第三届全国工业催化技术及应用年会论文集[C];2006年
2 袁书林;谭佩毅;;龙虾壳聚糖的制备条件优化及其对断奶仔猪生长和免疫功能的影响[A];中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛论文集[C];2010年
3 彭锟;林毅;黄小红;沙莉;苏争先;蔡文旋;张鸿声;;苏云金杆菌几丁质酶的研究[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘东;苏云金芽孢杆菌几丁质酶特性分析及其基因启动子序列的确定[D];南开大学;2010年
2 刘宏波;甘蓝型油菜抗病虫基因遗传转化及转基因植株抗性鉴定的研究[D];浙江大学;2010年
3 刘小民;华北大黑鳃金龟中肠cDNA文库的构建及其围食膜靶标蛋白的分离与鉴定[D];河北农业大学;2011年
4 李琴;天然高分子材料在渗透汽化膜分离己内酰胺—水体系中的应用[D];武汉大学;2009年
5 张计育;湖北海棠抗病相关基因的克隆及其功能分析[D];南京农业大学;2011年
6 史彬林;壳聚糖对肉仔鸡生长性能和免疫功能的影响及其机理的研究[D];中国农业大学;2005年
7 黄小红;棉铃虫N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质研究[D];福建农林大学;2005年
8 刘波;超嗜热古菌Pyrococcus horikoshii OT3几丁质代谢途径及相关嗜热酶系的研究[D];山东大学;2007年
9 杜欣军;中国明对虾先天免疫的模式识别与效应分子[D];山东大学;2007年
10 丁学知;苏云金杆菌4.0718菌株的cry杀虫基因和功能蛋白质组学研究[D];湖南农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 夏天;GS115-pPIC9k-ChiA4.0工程菌发酵生产HaSNPV几丁质酶的分离提取、杀虫抑菌机制及大田防治的研究[D];西北大学;2011年
2 李慧;呋喃虫酰肼对舞毒蛾生物活性及其作用机理研究[D];东北林业大学;2011年
3 张洁;壳聚糖衍生物/碳纳米管传感器的研究及应用[D];济南大学;2011年
4 时杰;废弃虾蟹壳的资源化利用技术研究[D];海南大学;2011年
5 樊晓贺;壳聚糖复合吸附剂和微球吸附剂的微波制备及其性能研究[D];华南理工大学;2011年
6 范冰;壳聚糖衍生物的制备及其抑菌性研究[D];中国海洋大学;2011年
7 任丽宏;壳聚糖微/纳米分散体系的抑菌性研究[D];中国海洋大学;2011年
8 倪永标;光谱法研究8Q5SAC与牛血清白蛋白相互作用[D];江西师范大学;2011年
9 杨兵;裂褶菌F17锰过氧化物酶固态发酵的条件优化及其扩大培养[D];安徽大学;2011年
10 杨晓雪;棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在毕赤酵母中的表达[D];哈尔滨工业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 侯绍金,徐志宏;金纹细蛾跳小蜂初步研究[J];山东农业科学;1989年01期
2 任兰田;傅玉珊;张福珍;;怎样防治金纹细蛾[J];北方果树;1987年01期
3 任兰田;张福珍;付玉珊;王淑杰;;金纹细蛾性诱剂田间诱蛾活性试验初报[J];北方果树;1988年03期
4 任兰田;张福珍;付玉珊;王淑杰;;金纹细蛾生物学特性的研究[J];北方果树;1989年03期
5 赵艳华;金纹细蛾在牡丹江地区消长规律初报[J];北方园艺;1995年04期
6 曹克强,王爱茹,杨军玉,李春强,李红梅;河北中部地区苹果、梨主要病虫害危害现状及分析[J];河北农业大学学报;1998年03期
7 郑连英;壳聚糖水解酶的筛选[J];材料研究学报;2000年02期
8 岳贵花,杨芃原,沈先荣,吉冬梅,任大明,刘为平,许云敏,王洪海;鲨鱼软骨血管抑制因子的高效液相色谱与电喷雾质谱研究[J];高等学校化学学报;1999年12期
9 梁爱华,李晓玲,苏智广,王伟,孙毅;东亚钳蝎昆虫毒素BmKIT的cDNA序列分析[J];高技术通讯;1999年06期
10 施汉威;;梭子蟹的甲壳质利用[J];海洋渔业;1981年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张洁,蔡敬民,吴克,金胜先,潘仁瑞,樊美珍;球孢白僵菌Bb174固态发酵产几丁质酶产酶及酶学特征研究[J];应用生态学报;2004年05期
2 李华,刘开启,王革;微生物几丁质酶在植物病害生物防治中的应用[J];仲恺农业技术学院学报;2003年01期
3 戴富明,徐同;农杆菌介导木霉几丁质酶基因转化拟南芥及其T_1代对油菜菌核病抗性提高[J];上海交通大学学报(农业科学版);2005年01期
4 A.Verloop;C.D.Ferrell;陈宗懋;;苯甲酰基苯脲类——一类新的干扰几丁质沉积的杀幼虫剂[J];世界农药;1979年04期
5 江振莹;;日粮中添加几丁质、葡糖胺和纤维素对鱼生长的影响[J];饲料广角;1989年02期
6 张学昆,李加纳,唐章林,谌利,陈云坪,陈洪源,郭益红;油菜几丁质酶的特点及其与抗菌核病的关系[J];西南农业大学学报;2001年03期
7 杨合同,黄玉杰,郭勇,李纪顺;木霉菌的几丁质酶与植病生防[J];山东科学;2003年01期
8 杨虹琦,罗泽民;菜豆种子几丁质酶的分离纯化及性质研究[J];湖南农业大学学报;1998年03期
9 黎定军,罗宽;抗源蛋白质在植物基因工程中的应用[J];世界农业;2000年06期
10 丁笑生,段红英,卢龙斗;植物几丁质酶及其在油菜抗真菌病害中的作用[J];河南农业科学;2005年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘明艳;田玉敬;张洪斌;;昆虫几丁质酶的分离纯化及其抑制剂筛选的研究[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
2 李力;黄胜元;关雄;;产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件[A];全国生物防治暨第八届杀虫微生物学术研讨会论文摘要集[C];2000年
3 邱立友;汪世山;余功德;吴云汉;;几丁质酶产生菌的筛选及产酶条件的研究[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年
4 蔡银杰;;几丁质用于植物病害生物防治——几丁质对土壤微生物的作用[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年
5 刘玉春;周志刚;何夙旭;姚斌;;基于免培养技术对蟹塘底泥细菌及几丁质酶基因多样性的分析[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
6 谢池楚;蔡峻;刘传;陈月华;;苏云金芽胞杆菌几丁质酶的基础表达及诱导合成的多态现象[A];2010年第四届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2010年
7 赵培静;夏枫耿;缪承杜;任文彬;黄俊生;;一株产几丁质酶芽孢杆菌分离鉴定及其活性的初步研究[A];十一五农业环境研究回顾与展望——第四届全国农业环境科学学术研讨会论文集[C];2011年
8 彭锟;林毅;黄小红;沙莉;苏争先;蔡文旋;张鸿声;;苏云金杆菌几丁质酶的研究[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
9 钟万芳;郭慧芳;方继朝;;Serratia sp.几丁质酶基因的比较研究[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
10 邱君志;陈宇熹;;虫生真菌座壳孢几丁质酶的初步研究[A];第八届海峡两岸菌物学学术研讨会论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 林岳夫;海洋微生物几丁质酶研究取得进展[N];中国海洋报;2001年
2 中国农科郑州果树研究所研究员 冯义彬 提供;金纹细蛾[N];河南科技报;2006年
3 张嘉美;苹果金纹细蛾的发生与防治[N];山西科技报;2005年
4 山西省晋中市农业局 焦瑞莲;运用性诱剂防治苹果害虫[N];河北科技报;2006年
5 省经济作物服务中心 刘敏彦;富士苹果膨大期病虫防治[N];河北科技报;2006年
6 王立明;套袋苹果后期如何管理[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2007年
7 丽水市农业局信息中心;春季果园病虫害防治方法[N];丽水日报;2006年
8 记者 任平;果树幼果期谨防病虫侵害[N];山西科技报;2007年
9 陈嫣;春季果园病虫防治方法[N];临汾日报;2007年
10 李奎;高温高湿病虫多 果园重防七八月[N];江苏农业科技报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郝之奎;Chitinolyticbacter meiyuanensis的筛选鉴定及其发酵产几丁质酶研究[D];江南大学;2011年
2 沙莉;苏云金芽胞杆菌几丁质酶活性研究[D];福建农林大学;2011年
3 缑敬轩;几丁质及高附加值产物酶法生产关键技术研究[D];陕西科技大学;2012年
4 刘东;苏云金芽孢杆菌几丁质酶特性分析及其基因启动子序列的确定[D];南开大学;2010年
5 屈明博;亚洲玉米螟几丁质合酶基因表达与生理功能研究[D];大连理工大学;2012年
6 刘晓健;飞蝗几丁质合成关键基因特性及转录调控研究[D];山西大学;2013年
7 肖亮;地衣芽孢杆菌MY75几丁质酶特性及表达调控元件的研究[D];南开大学;2010年
8 王凯;黄曲霉生防菌的筛选鉴定及高效菌株JPP1的生防机制[D];哈尔滨工业大学;2013年
9 孙培莉;酸性哺乳动物几丁质酶在支气管哮喘发病机制中的作用[D];南京医科大学;2008年
10 袁照年;甘薯抗蔓割病突变体的离体筛选及几丁质酶基因导入研究[D];福建农林大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 仙笑笑;金纹细蛾I型几丁质酶的表达、纯化及酶学活性测定[D];太原理工大学;2013年
2 沙莉;苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶基因的克隆、表达及其工程菌的构建[D];福建农林大学;2004年
3 伊亚莉;紫花苜蓿几丁质酶Class Ⅰ基因的克隆、序列分析及其表达[D];中国农业科学院;2011年
4 唐勇军;几丁质酶产生菌的筛选及初步应用的研究[D];湖南农业大学;2003年
5 占智高;家蚕表皮型几丁质合成酶基因的克隆及表达分析[D];西南大学;2010年
6 魏巍;棉铃虫几丁质酶cDNA克隆及表达研究[D];中国农业科学院;2002年
7 孙兰英;几丁质酶基因对黄瓜遗传转化的研究[D];东北农业大学;2003年
8 林成增;稻瘟病菌假定几丁质酶基因功能分析[D];福建农林大学;2010年
9 周樱;豚鼠气单胞菌CB101中几丁质酶基因的克隆及其异源表达的全酶蛋白和酶片段的功能研究[D];厦门大学;2002年
10 钟万芳;苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因及几丁质酶基因的克隆与特征分析[D];西南农业大学;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026