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《山西农业大学》 2015年
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绵羊ANGPTL4基因克隆、表达、多态性及其与性状的关联研究

张静  
【摘要】:血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)兼有促进脂肪沉积和脂肪酸氧化的作用。一方面,它通过抑制脂蛋白脂肪酶活性而抑制脂肪水解,导致脂代谢相关疾病的发生。另一方面,通过加强儿茶酚胺或糖皮质激素的活性而促进脂肪分解。目前,对于该蛋白及其编码基因的研究已有报道,但在绵羊中未见报道。本研究在DNA.RNA和蛋白三个水平上对ANGPTL4基因的结构和功能,mRNA和蛋白的表达以及ANGPTL4基因5’非编码区的多态性进行了研究,并与相关性状进行了关联分析。利用RT-PCR技术克隆了绵羊ANGPTL4基因的编码区序列(coding sequence, CDS),用生物信息学方法分析了CDS区及其编码的氨基酸序列。以具有显著脂尾型差异的脂尾型绵羊:广灵大尾羊和小尾寒羊,共96只为研究对象,用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR)技术,检测了ANGPTL4 mRNA在2、4、6、8、10、12,共6个年龄组的7种脂肪组织(大网膜、小网膜、皮下、腹膜后、’肾周、肠系膜以及尾部)中的相对表达量,并与两品种的尾性状和屠宰性状进行了关联研究。用Western blotting技术检测了ANGPTL4蛋白在两品种母羊的4种脂肪组织(皮下、腹膜后、肾周以及尾部)中的相对表达量。用PCR-SSCP技术检测了96只个体的ANGPTL4基因5’非编码区的单核苷酸多态性(SNP),并与相关性状进行了关联研究。主要结果如下:(1)绵羊ANGPTL4基因CDS区长1233 bp,编码410个氨基酸。预测的ANGPTL4蛋白的等电点为9.02,属于碱性蛋白,相对分子量45.5 kDa。该蛋白是一种不稳定的亲水蛋白。作为一个分泌蛋白,它含有一个长为24 AA的信号肽,3次跨膜。氨基酸序列中有一个N-糖基化位点和一个O-糖基化位点,18个磷酸化位点。进化分析表明,绵羊与牛的亲缘关系最近。(2)ANGPTL4 mRNA在广灵大尾羊和小尾寒羊两品种中存在时空表达差异。品种、月龄、组织对ANGPTL4 mRNA表达影响极显著(P0.001)。在广灵大尾羊中的表达量显著高于小尾寒羊。10月龄时的表达量显著高于其它月龄,浅层脂肪组织中的表达量高于在深层脂肪组织。性别影响不显著但是公羊表达量稍低于母羊。品种与月龄(P0.001)、品种与组织(P0.01)和性别与组织(P0.01)间的互作也影响ANGPTL4mRNA的表达。mRNA表达量与屠宰和尾型性状之间的相关性因品种差异而不同。广灵大尾羊各组织中的表达量均与性状呈正相关,其中,皮下、腹膜后、大网膜和小网膜中的表达量与各性状的相关显著。小尾寒羊大网膜和腹膜后脂肪中的表达量与大多数性状呈负相关,其余为正相关。(3)品种、月龄和组织对ANGPTL4蛋白的相对表达量影响极显著(P0.001)。品种与月龄的互作对该蛋白的表达也有显著影响(P0.01)。ANGPTL4蛋白的表达与其mRNA的表达总体趋势一致。(4)检测到ANGPTL4基因5'非编码区的8个SNPs中3个为颠换,5个为转换。显著的品种间差异发生在-1691 CG和-577 TG中。-2361 AG,-2288 GC和-1855AG的等位基因频率品种间差异不显著,但在广灵大尾羊中检测到3种基因型,而在小尾寒羊中只检测到两种基因型。-1691 CG和-1625 GA均以正向超显性遗传方式影响两个品种的尾长、宰前体重和胴体重,以负向超显性效应方式影响广灵大尾羊的屠宰率。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S826;Q78

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