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《山西农业大学》 2018年
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大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探

李真真  
【摘要】:GRPs(Glycine-rich proteins,富含甘氨酸蛋白),一类结构简单,且富含甘氨酸的高度重复序列组成的一个大家族蛋白,其在植物生长发育、生物防御、非生物胁迫响应等过程中起着重要作用。课题组前期发现一个在pol型细胞质雄性不育和可育植株花蕾中存在表达差异的基因BrGRP1,且在不育花蕾中表达量较高。本试验主要通过cDNA文库构建和筛选、BrGRP1过表达载体构建及遗传转化、转基因植株抗逆性鉴定等研究,初步揭示该基因的生物学功能。主要研究结果如下:(1)以大白菜不育系16C14花蕾为试验材料,采用SMART(switching mechanism at 5' end of RNA transcript)技术合成 cDNA,利用 DSN(duplex-specific nuclease)对所得cDNA进行均一化处理,之后与pDONRTM/Zeo载体重组并转化DH10B大肠杆菌菌株,构建了大白菜pol型雄性不育花蕾均一化cDNA文库。经检测,文库滴度为3.2×106 cfu/mL,库容量约为1.28×10 cfu,重组率97%,插入片段平均大小1.2kb左右。随机挑选100个阳性菌斑进行测序,冗余度仅为3.7%。(2)以文库质粒为模板,利用特异引物GRP-F/R成功克隆到BrGRP1基因cDNA序列。序列分析表明BrGRP1基因完整的ORF(Open Reading Frame,开放阅读框)为804 bp,编码267个氨基酸,分子量为29.7 kDa,等电点为7.3;其编码的BrGRP1蛋白为非跨膜蛋白,也不是分泌蛋白。与白菜基因组预测基因Bra004066序列相似性为93%,拟南芥At1G6787 基因的相似性为65%。(3)利用无缝克隆技术成功构建过表达载体Cam35S-BrGRP1,进一步进行拟南芥遗传转化。通过抗生素抗性筛选和PCR鉴定共获得7个拟南芥转基因纯系,从中随机选取了三个转基因T3代纯系(GRP1,GRP4和GRP5)进行后续试验。与野生型相比,转基因拟南芥在表型上没有发生变化;qRT-PCR分析表明BrGRP1在转基因拟南芥中高效表达。逆境响应研究表明:0.3μmmol/LABA、100 mmol/LNaCl处理可抑制转基因拟南芥种子萌发和幼苗生长。以上结果表明该BrGRP1基因可能参与ABA信号转导过程及NaCl胁迫响应过程。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S634.1

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1 李真真;大白菜富含甘氨酸蛋白BrGRPl的功能初探[D];山西农业大学;2018年
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