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《山西农业大学》 2005年
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纳豆激酶的纯化及其单克隆抗体的制备鉴定

杨宁  
【摘要】:纳豆激酶(Nattokinase)是由纳豆菌在发酵大豆过程中产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。国内外研究表明,在纤维蛋白平板试验、动物血栓模型试验和临床试验中,纳豆激酶都表现了明显的溶栓作用。其通过食品发酵而来,在胃肠环境中不会失活,可通过消化道吸收,不仅溶栓效率高、疗效时间长,且安全可靠。所以将纳豆激酶制品开发成口服型溶栓药物及保健食品的前景广阔。纳豆激酶单克隆抗体的制备对于纳豆激酶的分析鉴定和定量检测极为重要。 本研究采用硫酸铵分级盐析、透析、浓缩、Sephadex G-100柱层析和CM-sepharose FF等一系列纯化方法,对纳豆激酶的粗酶液进行分离纯化,结果总蛋白由4978mg降低到7.2mg,总酶活力由106723 UK unit降低到5112 UK unit,但比活力由21.43UKu/mg升高到709.2UKu/mg,即比活力提高了33.09倍,且经SDS-PAGE检测为单一蛋白带,证明为纯的纳豆激酶。 以纯化的纳豆激酶作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取四次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,得到两株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。细胞融合后初步筛选得到98个阳性孔,经过2次亚克隆,反复筛选得到了2株较稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为NA3、NT5,效果较理想。经单克隆抗体亚型鉴定,NA3属于IgG类和IgG2a亚类。间接ELISA测得纳豆激酶单克隆抗体腹水及其细胞培养上清的效价都高达1:10~6。NA3和NT5细胞株在连续继代培养(包括冻存和复苏)4个月后,单克隆抗体效价不变,仍为1:10~6。即NA3和NT5杂交瘤细胞株分泌单抗能力没有下降,稳定性良好。 经间接ELISA反应证实,所获得的纳豆激酶单克隆抗体是特异性针对纳豆芽孢杆菌的。 本研究将极大地有助于纳豆激酶口服溶栓药物的开发。
【学位授予单位】:山西农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:TS214.2

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