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兽用疫苗中霉形体污染的套式PCR检测技术研究

李彦明  
【摘要】:霉形体是一类重要的病原微生物,它能够污染细胞和疫苗等生物制品,潜伏着传播霉形体病的危险,从而影响到动物的防病灭病效果,所以对疫苗中霉形体污染的检测显得十分重要。 本实验通过从Genbank 中登录的鸡源霉形体(鸡毒霉形体)和猪源霉形体(猪肺炎霉形体、猪滑液霉形体和絮状霉形体)的16s rRNA 基因序列,应用DNAStar 软件和Primer 5.0 软件自行设计了套式PCR 引物。⑴外套引物序列:上游引物P1 为5′-TGG GGA GCA AAC AGG ATT A-3′,下游引物P2 为5′-TTG TAG TAG CCA TTG TAG CAC G-3′。⑵针对鸡源霉形体的内套引物1 序列:上游引物P3 为5′-AAC CTT ACC TAG ACT TGA CAT C-3′,下游引物P4 为5′-GGC AGT CTC GTT AGA TAA AGT–3′。⑶针对猪源霉形体的内套引物2 序列:上游引物P5 为5′-ATC CGC CTG AGT AGT ATG-3′,下游引物P6 为5′-GCA GTA TCT CTA GGG TTC TC-3′。将上述四种霉形体培养离心收集,然后提取纯化霉形体DNA,进行PCR 体系的优化设计,最后用建立的套式PCR 扩增体系和条件对从市场上随机购买的30 支鸡新城疫Ⅰ系活疫苗样品、30 支鸡新城疫La Sota 系活疫苗样品和35 支猪瘟活疫苗样品进行检测。结果显示本实验建立的套式PCR扩增体系和条件可以从疫苗样品中检测到霉形体污染,外套引物的检出率为24.2%(23/95),内套引物1 的检出率为21.1%(20/95),内套引物2 的检出率为14.7%(14/95)。该套式PCR 体系的建立,有望制备成试剂盒,在生产实践中发挥一定的作用。


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