青蒿素类药物通过hPXR和hCAR对CYP3A4和CYP2B6转录调节作用的体外研究

【摘要】：目的：青蒿素类药物在疟疾的治疗中发挥着非常重要的作用，但其缺点是存在自身诱导代谢现象，故复发率高。近年来，研究发现人孤儿核受体孕烷X受体（hPXR）和组成型雄烷受体（hCAR）作为关键的转录调控因子参与了药物代谢酶的基因表达，分别主要介导CYP3A4和CYP2B6的表达，而CYP2B6是人体内介导青蒿素类药物代谢的主要同工酶，CYP3A4也参与其部分代谢。本课题旨在研究青蒿素类药物能否在体外模型结肠腺癌细胞LS174T中通过激活hPXR和hCAR诱导CYP3A4、CYP2B6的表达，从而阐明其对CYP3A4和CYP2B6诱导代谢机理。 方法： （1）采用MTT法检测不同浓度药物，分别作用不同时间后细胞的增殖情况，计算各抑制率和半数抑制浓度（IC50）。 （2）构建及优化双报告基因检测系统：通过试剂盒抽提获得高质量的质粒DNA，使用阳离子脂质体法瞬时共转染不同比例的荧光素酶报告基因质粒pGL3-CYP3A4/CYP2B6、核受体表达质粒pcDNA3-hPXR/hCAR以及内参海肾荧光素酶表达质粒pRL-TK于LS174T细胞中，分别用hPXR的阳性药物利福平（RIF），hCAR的阳性药物CITCO，溶剂对照0.1%DMSO作用于细胞，最后检测萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶的活性，每孔的荧光素酶值用海肾荧光素酶的活性值校正，诱导倍数为阳性药物组与溶剂对照组荧光素酶校正值的比值。并摸索转染试剂的用量、转染时间、抑制剂浓度等，以期得到最高灵敏度。 （3）采用优化后的双报告基因检测系统，转染质粒pcDNA3-hPXR、pGL3-CYP3A4/CYP2B6和pRL-TK后，以青蒿素（ART）、双氢青蒿素（DHA）和蒿甲醚（AM）为青蒿素类抗疟药的代表药物，分别用5μmol·L~(-1)~240μmol·L~(-1)的ART，3μmol·L~(-1)~60μmol·L~(-1)的DHA，5μmol·L~(-1)~240μmol·L~(-1)的AM处理24h，阳性对照为RIF，溶剂对照为0.1%DMSO。转染pcDNA3-hCAR、pGL3-CYP3A4/CYP2B6和pRL-TK后，加入hCAR的抑制剂Androstenol，使hCAR的活性保持在同一较低水平，并用上述各药物浓度处理，阳性对照为CITCO，溶剂对照为0.1%DMSO。统计分析采用Dunnet-t检验。 结果：（1）3种药物的抑制率随药物浓度的增大而增加，IC50随着时间的延长而降低。ART作用24h、48h、72h对LS174T的IC50分别为240μmol·L~(-1)、240μmol·L~(-1)、211.18μmol·L~(-1)，DHA为91.46μmol·L~(-1)、80.45μmol·L~(-1)、45.60μmol·L~(-1)，AM为320μmol·L~(-1)、262.90μmol·L~(-1)、163.93μmol·L~(-1)。（2）转染条件优化结果：转染试剂Lipofectamine2000的最佳用量为每800ng质粒使用1.8μl，转染时间5h时效率较高，无明显细胞毒性。转染150ng表达基因质粒pcDNA3-hCAR/hPXR、600ng报告基因质粒pGL-CYP2B6/3A4和50ng内参质粒pRL-TK时诱导倍数最大，灵敏度最高，故采用此比例进行后续实验。（3）ART、DHAand AM3种药物各浓度均出现了不同程度的诱导:①ART在实验浓度范围内通过激活hCAR对CYP2B6和CYP3A4的诱导作用均有统计学意义，但是随着处理浓度的增大，诱导倍数变化不明显，且无趋势；通过hPXR对CYP2B6和CYP3A4的诱导呈明显的浓度—效应关系，但在较低浓度5μmol·L~(-1)~20μmol·L~(-1)ART对CYP2B6的诱导作用无统计学意义。②10μmol·L~(-1)~60μmol·L~(-1)的DHA通过hCAR对CYP2B6的诱导随浓度的增加而增大，且有统计学意义；40μmol·L~(-1)~60μmol·L~(-1)能通过hCAR对CYP3A4产生有意义的诱导。DHA通过激活hPXR显著诱导CYP2B6和CYP3A4表达的浓度范围均为20μmol·L~(-1)~60μmol·L~(-1)3个浓度。③AM通过hCAR介导对CYP2B6的诱导作用在5μmol·L~(-1)~20μmol·L~(-1)时有统计学意义，最高值出现在20μmol·L~(-1)；AM通过hCAR介导对CYP3A4的诱导作用在实验浓度范围均有统计学意义，最高诱导倍数也是出现在20μmol·L~(-1)。20μmol·L~(-1)~120μmol·L~(-1)的AM能够通过hPXR显著诱导CYP2B6，20μmol·L~(-1)时达最大值；通过hPXR对CYP3A4的诱导倍数最大值出现在40μmol·L~(-1)，大于10μmol·L~(-1)均能产生显著诱导作用。结论：ART、DHA和AM作为配体激活了核受体CAR和PXR，从而诱导了CYP2B6和CYP3A4的表达，在报告基因水平阐明了青蒿素类药物的诱导机制。并且在肠细胞LS174T中验证了这一通路，说明此类药物可能对肠道首过代谢有诱导作用。