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培美曲塞诱导神经管畸形动物模型及其机制的研究

赵婕  
【摘要】:研究目的:本研究利用抗叶酸代谢药培美曲塞(PMX)对C57BL/6J孕鼠进行药物干预,通过对孕鼠胚胎形态学观察及其他指标的检测,筛选出最佳的给药剂量和时间,建立叶酸代谢障碍的C57BL/6J小鼠胚胎神经管畸形(neural tube defects, NTDs)动物模型;采用微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)检测PMX诱导NTDs模型基因组拷贝数变异;应用全基因组表达谱芯片技术检测PMX诱导NTDs模型的基因表达谱,筛选可能的PMX引起NTDs的致病基因;初步探讨PMX对NTDs发生发展的影响及相关发病机制的研究。 研究方法:本研究中将7-8周健康雌性C57BL/6J小鼠随机分两组受孕,给药实验组于孕7.5(E7.5)天腹腔注射PMX,摸索适当的给药剂量并建立神经管畸形动物模型,正常对照组按体重注射同等剂量的生理盐水。在孕11.5(E11.5)天,颈椎离断处死实验组和正常对照组孕鼠,取胚胎于在解剖显微镜下观察胚胎神经管畸形的外部特征;经固定、切片、染色后,光镜下观察畸胎情况及神经管形态改变;高效液相色谱法首先测定PMX干预孕鼠的不同时间点的叶酸及代谢产物水平;ELISA方法检测PMX诱导的E7.5天胚胎组织叶酸水平;测定胚胎组织的二氢叶酸还原酶(DHFR)活性;RT-PCR法检测胚胎组织叶酸代谢途径关键酶的基因表达水平。应用高分辨微阵列比较基因组杂交技术检测PMX诱导小鼠NTDs模型基因组拷贝数变异,经过生物信息学UCSC比对并应用RT-PCR分析;应用全基因组表达谱芯片技术高通量筛选出在NTDs小鼠胚胎中异常表达的基因,并对这些差异表达基因进行GO分析,对所筛选出的Ptch1基因、Endog基因进行T-PCR方法进行验证。体外实验检测PMX对小鼠胚胎干细胞氧化应激损伤;应用单细胞凝胶电泳方法检测PMX对小鼠胚胎干细胞的DNA损伤的影响。 研究结果: 1.PMX具有明显的胚胎致畸性,可导致孕鼠子宫明显充血、淤血,大体外观可见吸收胎、胎鼠发育迟缓及NTDs形态表现,HE染色可见NTDs胎鼠后脑泡未闭合。 2.E7.5天注射PMX后,在4、12小时孕鼠血中叶酸明显高于正常,24、96h接近于正常水平:5-FoTHF变化不大,5-MeTHF,,SAM, SAH四个指标表现不同程度的降低,在24h开始慢慢恢复,但96h仍低于正常水平,具有统计学意义p<0.05。,同时PMX明显降低实验组的胚胎组织叶酸水平。DHFR活性在4-8小时后降到最低,仅为正常小鼠胚胎组织的15%,随后DHFR的活性开始恢复,但是在PMX注射24小时后,DHFR活性仍然低于正常水平。实验组小鼠胚胎组织结果显示实验组小鼠胚胎组织亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和腺苷酸合酶(TS)的mRNA表达水平低于对照组小鼠胚胎组织(p<0.05)。 3.应用高分辨微阵列比较基因组杂交技术(Array comparative genomic hybridization, aCGH)对NTDs小鼠胚胎基因组拷贝数变异(Copy numbervariations,CNVs)进行检测,结果显示共筛选出313个拷贝数变异片段,包含101个变异基因。在表达谱中筛选出的差异表达基因共165个,表达上调的基因有96个,表达下调的基因有69个。这些与正常组织表达有差异基因包括代谢相关基因;发育相关基因;信号转导相关基因;转录相关基因;物质转运相关基因;应激相关基因;离子转运相关基因;细胞凋亡相关基因;细胞增殖相关基因;细胞分化相关基因;细胞粘附相关基因;细胞周期相关基因等。其中RT-PCR验证结果与表达谱芯片结果一致(p<0.05)。 4.单细胞凝胶电泳结果显示PMX对小鼠胚胎干细胞DNA有损伤,并且有剂量依赖性。随着PMX浓度的增加,DNA拖尾越明显;同时造成小鼠胚胎干细胞的氧化应激损伤。 结论: 1.PMX能成功的诱导C57BL/6J小鼠胚胎NTDs,是一种接近人类的NTDs的动物模型。 2.抗叶酸代谢药PMX可以抑制小鼠叶酸及其相关产物的代谢,NTDs胚胎发生基因组拷贝数变异。 3.Ptch1基因的上调和Endog基因表达的下调在PMX致NTDs的发生过程中发挥重要作用,可能是PMX致NTDs发生的候选基因。 4.体外实验中,PMX可以损伤小鼠胚胎干细胞DNA,造成小鼠氧化应激损伤,使胚胎干细胞发生凋亡,最终使神经管不能发生正常闭合,而导致神经管畸形的发生。


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