Nrf2/ARE通路在PM_(2.5)对人脐静脉血管内皮细胞损伤及Rg1减轻该损伤中的作用

【摘要】：第一部分PM_(2.5)三种提取成分对血管内皮细胞的毒性研究 研究目的：研究大气细颗粒物PM_(2.5)三种提取成分（有机和水溶、酸溶提取成分）的细胞毒性。 研究方法：采用大气细颗粒物PM_(2.5),以人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）为靶细胞,研究PM_(2.5)三种提取成分浓度0、50、100、200、400、800、1200μg/ml对细胞活力及氧化损伤毒性，采用MTT法染毒48小时后测定细胞的存活率，染毒6小时后荧光显微镜检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的变化，测定丙二醛(MDA)水平。 研究结果：大气细颗粒物PM_(2.5)的三种提取成分染毒细胞后随着染毒剂量的增加细胞存活率呈下降趋势, ROS、丙二醛(MDA)则呈现增高趋势，染毒浓度为50、100、200、400、800、1200μg/ml有机成分细胞存活率分别为97.00±1.80、95.33±2.30、69.07±3.61、54.82±4.32、30.77±4.09、22.08±4.23(P0.05)，水溶成分细胞存活率分别为99.00±1.00、99.02±0.57(P0.05)、91.06±3.21、83.17±1.54、71.34±3.26、59.28±2.45(P0.05)，酸溶成分细胞存活率分别为99.06±0.82、98.97±2.18、96.85±3.23(P0.05)、90.28±2.15、85.32±1.73、79.28±2.98(P0.05)，染毒浓度为50、100、200、400、800μg/ml，有机成分细胞ROS分别为154±11、164±10(P0.05)、214±17、224±17、241±27(P0.05)，水溶成分细胞ROS分别为159±46、160±58(P0.05)、220±36、228±43(P0.05)，酸溶成分细胞ROS分别为164±9、168±7、170±17(P0.05)、196±18、204±11(P0.05)，有机成分细胞MDA分别为0.88±0.09(P0.05)、0.89±0.19、1.27±0.21、1.87±0.36、1.96±0.15(P0.05)，水溶成分细胞MDA分别为0.90±0.03、0.91±0.06、0.93±0.21(P0.05)、1.37±0.36、1.47±0.15(P0.05)，酸溶成分细胞MDA分别为0.91±0.24、0.93±0.20、0.96±0.34、1.01±0.15(P0.05)、1.50±0.15(P0.05)(P0.05)，与阴性对照组相比, P0.05具有统计学显著性，细胞的生存率有机提取成分染毒组低于水溶、酸溶成分染毒组，各染毒浓度组的氧化损伤及代谢指标水平在三种染毒成分之间认为有差别,有机提取成分染毒组高于水溶、酸溶成分染毒组。 研究结论：大气细颗粒物PM_(2.5)三种提取成分均具有一定的细胞毒性,且有机成分大于其它两种成分，氧化应激是细胞损伤途径之一。 第二部分Nrf2/ARE通路在PM_(2.5)对人脐静脉血管内皮细胞损伤及Rg1减轻该损伤中的作用 研究目的：探究PM_(2.5)诱导内皮细胞损伤以及Rg1对细胞的保护作用的可能机制 研究方法：将人脐静脉血管内皮细胞（以下用英文简称HUVECs）以PM_(2.5)及人参皂苷Rg1作用后，用CCK-8试验来测定HUVECs的增殖能力。HUVECs的氧化应激水平通过测定反应性氧化物（即ROS）和MDA来分析。对HO-1表达的影响用RT-PCR和印迹检测技术来测定。用激光共聚焦显微镜观察转录因子Nrf2的表达和核转位。 研究结果： PM_(2.5)浓度为200，400和800μg/ml，分别减少内皮细胞的活性30.7±2.8％，46.2±3.9％和70.2±2.8％，IC50值为526.9μg/ml。PM_(2.5)与Rg1共同孵育48小时，Rg1以2.5，10和40μg/ml浓度依赖性拮抗PM_(2.5)诱导的血管内皮细胞的活性下降。皂甙Rg1在2.5,10,40μg/ml分别使PM_(2.5)的IC50上升至592.3，825.6和1232.1μg/ml。 PM_(2.5)剂量依赖性地刺激内皮细胞氧化应激产生，皂甙Rg1预处理显著增加HO-1、Nrf2mRNA和蛋白表达，降低ROS和MDA水平。100-800μg/ml PM_(2.5)浓度依赖性增加细胞内的荧光。在空白组和PM_(2.5)800μg/ml培养人脐静脉内皮细胞的绿色荧光强度分别为148.0±4.0和241.0±7.0（P 0.01），皂甙Rg110μg/mL组和40μg/ml使最大的绿色荧光强度减少到216.0±2.0和206.0±3.0（P0.01）。PM_(2.5)在100-800μg/ml浓度依赖性地增加MDA含量，最高为1.96±0.09nmol/mg protein。空白组血管内皮细胞内的丙二醛浓度为0.87±0.07nmol/mg蛋白，皂甙Rg1在10和40μg/ml下降72.96％（P 0.01）和58.66％（P0.01）。使用激光共聚焦显微镜显示，Rg1导致PM_(2.5)诱导的Nrf2的显著增加。 Nrf2蛋白细胞质比细胞核的比例明显减少，相比PM_(2.5)组0.3和空白组0.4，在40μg/ml达到最高0.09。 研究结论：实验结果表明Rg1通过增大细胞抗氧化能力、上调HO-1表达避免了HUVECs的氧化应激从而弱化PM_(2.5)对细胞的毒化作用。此外，人参皂苷Rg1还可增强转录因子Nrf2的核转运，这也为人参皂苷Rg1可以通过Nrf2通路遏制PM_(2.5)在人脐静脉血管内皮细胞中的氧化应激从而保护血管内皮的机制提供了新的论据。第三部分RNA干扰Nrf2后PM_(2.5)有机提取成分对血管内皮细胞的毒性研究 研究目的：研究RNA干扰Nrf2后PM_(2.5)有机提取成分对血管内皮细胞的毒性及Rg1对细胞的保护。 研究方法：设计并构建了针对Nrf2的短发夹载体，采用脂质体转染细胞，选择ShRNA，以人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）为靶细胞，研究大气细颗粒物PM_(2.5)有机提取成分浓度400μg/ml对细胞活力及氧化损伤毒性及Rg1浓度40μg/ml对细胞的保护，采用MTT法测定细胞的存活率，荧光显微镜检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的变化，Western-blot检测HO-1蛋白的表达。 研究结果：用400μg/ml PM_(2.5)作用于细胞24小时，细胞的活性下降至54.86%。而shRNA表达克隆干扰Nrf2后,细胞的活性下降至36.94%。另外，用浓度为40μg/ml的Rg1作用细胞1小时后与PM_(2.5)共孵育，使得细胞活性上升至89.58%。而shRNA干扰Nrf2后,细胞的活性下降至42.14%。shRNA干扰Nrf2后,与非干扰组相比，细胞的活性下降均具有统计学显著性（P0.05）。shRNA干扰Nrf2后，用400μg/ml PM_(2.5)作用于细胞6小时，细胞ROS增高至224.0。而shRNA干扰Nrf2后，细胞ROS水平进一步增高至302.0。另外，用浓度为40μg/ml的Rg1作用细胞1小时后与PM_(2.5)共孵育，可以减弱400μg/ml PM_(2.5)导致的细胞毒性作用，并使得细胞ROS降低至164.0。而shRNA干扰Nrf2后,细胞ROS增高至平均271.0。shRNA干扰Nrf2后，与非干扰组相比，细胞ROS增高均具有统计学显著性（P0.05）。HO-1的表达，Westernblotting检测显示：用400μg/ml PM_(2.5)作用于细胞6小时，蛋白条带较对照组（1.0±0.1）增宽（1.7±0.1，P0.05），浓度为40μg/ml的Rg1作用细胞1小时后与PM_(2.5)共孵育，蛋白条带较PM_(2.5)组有所增宽（2.8±0.1，P0.05），而shRNA干扰Nrf2后，蛋白条带表达量即明显减少，近于无法测出（0.2±0.1，P0.05）（0.3±0.1，P0.05）。 研究结论：shRNA表达克隆干扰Nrf2后，Rg1对细胞的保护减弱。在人脐静脉细胞，PM_(2.5)及Rg1使Nrf2活性增强，促进HO-1抗氧化酶表达。Nrf2对大气细颗粒物PM_(2.5)有机提取成分对细胞毒性有保护作用，Nrf2通路的激活可能是Rg1对细胞的保护机制之一。