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《山西医科大学》 2015年
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1α,25二羟维生素D3对肺动脉高压的作用及microRNA机制研究

李飞  
【摘要】:第一部分1α,25二羟维生素D3通过micro RNA-27b靶向维生素D受体抑制人肺成纤维细胞的分化目的:1.探讨1,25(OH)2D3对于TGF-β1诱导人胚肺成纤维细胞分化的作用。2.探讨mi R-27b对于人肺成纤维细胞分化的调节作用。3.进一步研究mi R-27b的靶基因和作用机制。方法:1.细胞药物干预:细胞分为对照组(Control group)、TGF-β1模型组(TGF-β1 group)、TGF-β1模型加1,25(OH)2D3干预组(TGF-β1+VD group)。细胞培养皿中各组细胞密度生长至70-80%汇合时,给予无血清培养基培养血清饥饿24h,加入相应药物或对照物后用含2%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48h。各组加入药物或对照物如下:TGF-β1+VD组培养基中加入一定量的浓度为2 ug/ml人重组TGF-β1蛋白,使其终浓度为10 ng/ml,同时加入浓度为20 umol/L的1,25(OH)2D3溶液,使其终浓度为100 n M;TGF-β1组培养基中加入一定量的浓度为2 ug/ml人重组TGF-β1蛋白,使其终浓度为10 ng/ml,同时加入相应量的95%乙醇对照;Control组给予相应量的PBS溶液和95%乙醇对照。2.提取细胞总RNA和总蛋白,通过实时定量RT-PCR和Western blot以及免疫荧光方法检测细胞中α-SMA和VDR m RNA和蛋白的表达。3.提取细胞micro RNA,通过实时定量RT-PCR检测细胞中mi R-27b的表达。4.为明确mi R-27b是否调节人肺成纤维细胞的分化,在MRC5细胞中转染scramble、mi R-27b mimic或mi R-27b inhibitor并且分析α-SMA的表达水平;为进一步研究mi R-27b是否调节VDR基因的表达,在MRC5细胞中转染scramble、mi R-27bmimic或mi R-27b inhibitor并且分析VDR的表达水平。5.为明确mi R-27b是否直接靶向VDR 3’UTR,在荧光素酶报告基因载体构建过程中引入野生型和突变型VDR 3’UTR。这些载体与scramble,mi R-27b mimic或mi R-27b mimic+inhibitor共转染293A细胞,然后检测荧光素酶的活性。结果:1.1,25(OH)2D3对于TGF-β1诱导人肺成纤维细胞分化的作用以及VDR表达的影响:在MRC5细胞中,TGF-β1能显著提高α-SMA m RNA和蛋白表达水平;而1,25(OH)2D3则能有效抑制上述作用。TGF-β1能显著下调MRC5细胞VDR蛋白的表达,加入1,25(OH)2D3后VDR蛋白的表达上升,然而Control组、TGF-β1模型组、TGF-β1+VD组之间VDR m RNA水平没有显著差异。2.1,25(OH)2D3对TGF-β1诱导人肺成纤维细胞mi R-27b表达的影响:TGF-β1能显著上调MRC5细胞mi R-27b的表达,加入1,25(OH)2D3后能有效减少mi R-27b的表达。3.mi R-27b调节人肺成纤维细胞的分化和VDR蛋白的表达:mi R-27b的过表达显著上调α-SMA的m RNA和蛋白表达水平,而mi R-27b抑制剂明显下调α-SMA的m RNA和蛋白表达水平。而且,mi R-27b抑制剂减少TGF-β1诱导的肺成纤维细胞α-SMA m RNA和蛋白表达水平;mi R-27b过表达增加1,25(OH)2D3处理的肺成纤维细胞α-SMA m RNA和蛋白表达水平。mi R-27b的过表达显著下调VDR蛋白表达水平,而mi R-27b抑制剂明显上调VDR蛋白表达水平。然而,mi R-27b的过表达或mi R-27b抑制剂并不影响VDR的转录水平。而且,mi R-27b抑制剂具有抑制TGF-β1下调肺成纤维细胞VDR蛋白表达的作用;mi R-27过表达降低1,25(OH)2D3处理的肺成纤维细胞VDR的蛋白表达水平。在这种情况下同样地,mi R-27b抑制剂或mi R-27b过表达并不影响VDR的转录水平。4.mi R-27b对VDR 3’UTR的靶向作用:mi R-27b mimic能显著降低荧光素酶活性,加入mi R-27b inhibitor后,荧光素酶活性增加。然而,将VDR 3’UTR保守序列进行突变后,mi R-27b mimic或mi R-27b inhibitor对荧光素酶活性作用均消失。结论:1.浓度为100n M的1,25(OH)2D3能抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞分化,并且下调mi R-27b的表达。2.mi R-27b过表达降低人肺成纤维细胞VDR的蛋白表达并且增加α-SMA的表达,促进人肺成纤维细胞的分化,而抑制mi R-27b的表达则显示出相反作用。3.1,25(OH)2D3通过mi R-27b直接靶向VDR 3’UTR,从而抑制TGF-β1诱导的人肺成纤维细胞的分化。第二部分1α,25二羟维生素D3抑制野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压作用目的:1.利用皮下注射野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型,观察1,25(OH)2D3对肺血管病变的影响。2.1,25(OH)2D3早期干预对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中TGF-β1表达的影响。方法:1.实验动物及分组:32只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为4组:对照组(Control group)、1,25(OH)2D3组(VD group)、野百合碱模型组(MCT group)、野百合碱模型加1,25(OH)2D3干预组(MCT+VD group),每组8只。2.MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型建立及1,25(OH)2D3干预:MCT组、MCT+VD组每只大鼠给予野百合碱60mg/kg体重,背部皮下一次性注射;Control组、VD组仅给予相应生理盐水皮下注射。VD组、MCT+VD组在生理盐水或野百合碱注射的当日开始给予1,25(OH)2D3,按0.5ug/100g体重进行腹腔注射,每周两次,共3周;Control组、MCT组给予相应生理盐水腹腔注射。3.第22天行肺动脉平均压测定;并分离出大鼠心脏,沿室间隔仔细分离右心室和左心室+室间隔,计算右心室肥厚指数。4.肺组织标本切片、HE染色,光镜下观察肺小动脉结构,并计算中膜厚度占管腔的比例(WT%),血管壁中层横截面积占血管总横截面积百分比(MA%)。5.通过实时定量RT-PCR和Western blot方法检测肺组织中TGF-β1 m RNA和蛋白的表达。结果:1.1,25(OH)2D3对野百合碱诱导大鼠的肺动脉平均压、右心室肥厚指数及肺血管形态学指标的作用:野百合碱皮下注射3周后MCT组大鼠肺动脉平均压(m PAP)、右心室肥厚指数(RVHI)、WT%、WA%均较正常对照组明显增高,差异有统计学意义。1,25(OH)2D3干预后,MCT+VD组大鼠m PAP、RVHI、WT%、WA%均低于MCT组,差异亦有统计学意义。2.1,25(OH)2D3对野百合碱诱导大鼠的肺小动脉形态学的作用:大鼠肺组织切片HE染色的结果显示Control组、VD组大鼠肺组织光镜下可见肺动脉管壁较薄,管腔正常,血管周围无炎症细胞浸润。MCT组大鼠肺动脉管壁明显增厚,管腔显著狭窄,血管周围炎症细胞浸润明显。而MCT+VD组肺动脉结构清晰,管壁无明显增厚,肺动脉周围炎症细胞浸润少。3.1,25(OH)2D3对野百合碱诱导大鼠的肺组织中TGF-β1表达的影响:野百合碱皮下注射3周后MCT组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达较对照组明显增高,1,25(OH)2D3干预后,MCT+VD组大鼠TGF-β1蛋白表达量显著低于MCT组。然而Control组、MCT模型组、MCT+VD组之间TGF-β1 m RNA水平没有显著差结论:1.一次性给予大鼠皮下注射野百合碱(60mg/kg)3周后可成功建立大鼠肺动脉高压模型,出现肺动脉压力增加、肺血管重塑和炎症。2.1,25(OH)2D3早期干预可延缓野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉平均压的升高,改善肺血流动力学、肺血管重塑和右室肥厚。3.1,25(OH)2D3早期干预可降低MCT大鼠肺组织中的TGF-β1表达水平,从而减少肺血管重构的发生,减缓肺动脉高压的发展。第三部分1α,25二羟维生素D3抑制野百合碱诱导大鼠肺动脉高压的micro RNA机制研究目的:1.观察1,25(OH)2D3对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中α-SMA、VDR、COL1A1、OPN表达的影响。2.观察1,25(OH)2D3对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中mi R-27b表达的影响。方法:1.MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型建立及1,25(OH)2D3干预。2.第22天进行肺组织标本采集,冰冻切片,以及总RNA、总蛋白和micro RNA提取。3.通过实时定量RT-PCR和Western blot方法检测大鼠肺组织中α-SMA、VDR、COL1A1、OPN m RNA和蛋白的表达。4.通过实时定量RT-PCR检测大鼠肺组织中mi R-27b的表达。结果:1.1,25(OH)2D3对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中α-SMA、COL1A1、OPN表达的影响:野百合碱皮下注射3周后,MCT组大鼠肺组织中α-SMA、COL1A1、OPN m RNA和蛋白表达较对照组明显增高,而1,25(OH)2D3能有效抑制上述作用。2.1,25(OH)2D3对野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中VDR表达的影响:野百\合碱皮下注射3周后MCT组大鼠肺组织中VDR蛋白表达较对照组明显降低,1,25(OH)2D3干预后,MCT+VD组大鼠VDR蛋白表达量显著高于MCT组,然而Control组、MCT模型组、MCT+VD组之间VDR m RNA水平没有显著差异。3.1,25(OH)2D3对野百合碱诱导大鼠的肺组织中mi R-27b表达的作用:与对照组相比,MCT组大鼠肺组织中mi R-27b的表达明显增高。1,25(OH)2D3干预后,MCT+VD组大鼠肺组织中mi R-27b的表达明显低于MCT组。结论:1.野百合碱(60mg/kg)皮下注射3周后可诱导大鼠发生明显的肺血管重塑和炎症,大鼠肺组织肌成纤维细胞的生成增多,肺组织中α-SMA、COL1A1和OPN的表达上调。2.1,25(OH)2D3通过作用于VDR抑制野百合碱诱导的大鼠肺组织中α-SMA、COL1A1和OPN的表达。3.mi R-27b可能在野百合碱诱导的大鼠肺组织α-SMA蛋白表达中起调节作用。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R544.1

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