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《山西医科大学》 2016年
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PI3K在P2Y受体调控的AC/cAMP/Epac/Kv通道信号通路中的作用及对胰岛素分泌的影响

王慧  
【摘要】:目的:在胰岛β细胞中,P2Y嘌呤受体(P2YR)的激活可以产生葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌作用,我们课题组之前的研究发现P2YR调控的胰岛素分泌是通过AC/c AMP/Epac/Kv通道信号途径实现的,本实验通过全细胞膜片钳记录技术和检测胰岛素分泌量的实验来证明3-磷酸肌醇激酶(PI3K)参与了P2YR/AC/c AMP/Epac/Kv通道信号途径,从而进一步完善了P2YR调控胰岛素分泌的机制。方法:(1)大鼠断头处死后,用75%的酒精消毒腹部皮肤,将腹部剖开,在胆管上剪个小口,向胰腺内注入已准备好的胶原酶P,然后将胰腺组织剥离下来,放入38℃恒温水浴中让其消化11分钟后,终止消化,在1200转每分钟的条件下离心3分钟,弃去上清,再加10ml的1077分离液,在3200转每分钟的条件下离心23分钟,在体式镜下挑取质量比较好的胰岛(淡白色、透光率小、质感强、直径在100-300um间)。将分离得到的胰岛用DispaseⅡ消化成胰岛细胞,所得胰岛和细胞一般可在一周内使用。(2)分别用不同药物干预胰岛β细胞,用膜片钳技术检测各组药物对胰岛β细胞电压依赖性钾通道(Kv)的影响。(3)将分得的胰岛孵育24小时后,用放射性免疫分析法检测其在不同药物干预下胰岛素分泌的情况。结果:(1)用Histopaque-1077梯度离心法分得的胰岛,大小均匀,直径在200μm左右,呈椭圆形或圆形,透光率小,有质感,大多数胰岛包膜完整圆滑。用DispaseⅡ分离得到的胰岛β细胞呈球形,表面光洁,在显微镜下可见胰岛细胞呈单一或者几个相连成团地分布在视野中。(2)通过膜片钳实验得出,1μM蛋白激酶C(PKC)的抑制剂Ro31-8220、50μM Ras抑制剂FTS和20μM丝裂原激活的蛋白激酶(MEK)抑制剂PD98059都没有阻断P2Y受体激动剂ADPbS对Kv电流的抑制作用,在80m V时,记录电流密度为Ro31-8220+ADPbS(n=7,117.04±4.61p A/p F)、FTS+ADPbS(n=7,117.50±2.53p A/p F)和PD98059+ADPbS(n=7,112.58±3.36p A/p F)同ADPbS(n=7,111.35±2.39p A/p F)一样,与对照组相比P0.05。然而100 n M PI3K的抑制剂Wortmannin消除了ADPbS对Kv电流的抑制作用,在80m V时,记录电流密度为Wortmannin+ADPbS(n=7,143.51±3.91p A/p F)较对照组(n=7,145.24±2.51p A/p F)P0.05。10μM鸟嘌呤核苷酸转换因子(Epac)的激动剂8-p CPT-AM(CPT)也能抑制Kv电流,但Wortmannin可以阻断CPT对Kv电流的抑制作用,在80m V时,记录电流密度为CPT(n=7,111.36±4.96p A/p F)与对照组(n=7,145.31±3.21p A/p F)相比P0.01,CPT+Wortmannin(n=7,132.19±5.30p A/p F)与CPT(n=7,111.36±4.96p A/p F)相比P0.01。此外另一个PI3K的抑制剂BKM120在10μM浓度时也像Wortmannin一样消除了Epac激动剂CPT对Kv电流的抑制作用。(3)在胰岛素分泌实验中,PI3K的抑制剂Wortmannin和BKM120都抑制了ADPbS的促进胰岛素分泌的作用,用放射性免疫分析法检测每组胰岛素的含量,将所测得结果都以2.8m M葡萄糖组(2.8G)进行标化后再进行比较得出,8.3G(n=7,6.90±1.89)与2.8G(n=7,1±0.23)相比P0.01;8.3G+ADPbS(n=7,15.79±1.74)与8.3G(n=7,6.90±1.89)相比P0.05;8.3G+wortmannin(n=7,6.74±2.08)与8.3G(n=7,6.90±1.89)相比P0.05;wortmannin+ADPbS(n=7,8.97±1.80)较8.3G+ADPbS(n=7,15.79±1.74)P0.05;8.3G+BKM120(n=7,8.09±1.93)与8.3G(n=7,6.90±1.89)相比P0.05;BKM120+ADPbS(n=7,10.68±1.69)较8.3G+ADPbS(n=7,15.79±1.74)P0.05。结论:(1)PKC的抑制剂Ro31-8220、Ras抑制剂FTS和MEK抑制剂PD98059都没有阻断P2Y受体激动剂ADPbS对Kv电流的抑制作用。(2)PI3K的抑制剂Wortmannin能阻断P2Y受体激动剂ADPbS对Kv电流的抑制作用;同样地Wortmannin和BKM120可以明显地消除Epac的激动剂8-p CPT-AM对Kv电流的抑制作用。(3)PI3K的抑制剂Wortmannin和BKM120都消除了P2Y受体激动剂ADPbS的促进胰岛素分泌的作用。(4)PI3K是Epac和Kv通道之间的起关键作用的信号分子。(5)P2Y受体对Kv通道的调节作用依赖于PI3K信号途径。综上所述,在P2Y受体调控的胰岛素分泌中PI3K介导了Epac对Kv通道的调节作用,所以在胰岛β细胞中,PI3K参与了调控胰岛素分泌的P2YR/AC/c AMP/Epac/Kv通道信号途径。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R587.1

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