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《山西医科大学》 2017年
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28天吸入染毒纳米级炭黑气溶胶致小鼠肺组织损伤及细胞凋亡损伤机制研究

杨墨  
【摘要】:目的:1、探讨纳米级炭黑颗粒的小鼠亚急性吸入毒性效应,并为纳米级炭黑颗粒的危险性评价提供毒理学数据;2、探讨吸入纳米级炭黑气溶胶致小鼠肺组织细胞凋亡损伤机制研究。方法:1、96只8周龄雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为低剂量组(15mg/m~3)、高剂量组(30 mg/m~3)和阴性对照组(滤过的洁净空气)。利用气溶胶发生器将纳米级炭黑气溶胶吹入各染毒柜中,每天染毒6 h,连续28 d。染毒期间,实时动态监测染毒柜内炭黑颗粒的粒径分布、空间分布及浓度变化,每周检测一次各组小鼠饲料、水的消耗量及体重的变化情况。末次染毒后24 h,取小鼠静脉血进行血液学及临床生化检查;解剖收集肺、心、肾、脾、肝等脏器,称重计算其脏器系数,并行组织病理学检查;检测肺组织纤维蛋白和细胞凋亡的水平,并应用透射电镜(TEM)观察肺组织的超微结构;支气管肺泡灌洗后,镜下对灌洗液中细胞进行分类计数并测定总蛋白浓度。2、15只8周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为低剂量组(15mg/m~3)、高剂量组(30 mg/m~3)和对照组,采用全身暴露动式吸入染毒模型连续染毒28 d。末次染毒后24 h,解剖收集小鼠肺脏。肺组织解剖取材后立即剪下适当大小肺组织块,制备成肺组织单细胞悬液,采用DCFH-DA探针标记法检测小鼠肺组织单细胞悬液中活性氧(ROS)的活性;解冻小鼠肺组织后将其制备成10%肺组织匀浆,并在一周内采用酶联免疫吸附法(ELISA)法分别检测肺组织匀浆中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)等抗氧化酶的活性;分别采用trizol法和ripa裂解法从小鼠肺组织中提取总mrna和蛋白,并用实时荧光定量pcr(real-timepcr)、免疫印迹(westenblot)、及免疫组织化学(ihc)、三种方法检测小鼠肺组织中bcl-2、bax、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9、parp-1、fas等凋亡相关蛋白的表达水平。结果:1、连续染毒28d后,低剂量组炭黑气溶胶浓度约为(15.31±3.30)mg/m~3,高剂量组浓度约为(30.05±14.20)mg/m~3。染毒期间各组小鼠饲料、水的消耗量及体重变化均无显著差异。与对照组相比,染毒组小鼠血生化指标未见明显变化,血常规指标中只有红细胞计数、血红蛋白浓度和红细胞比容在染毒组中稍有增加。高剂量组小鼠肺脏器系数明显高于低剂量组和对照组(p=0.016),各剂量组心、肾脏器系数明显降低(p=0.001,p0.001)。各剂量组小鼠肺组织呈灰黑色,支气管腔、肺泡腔内均可见炭黑颗粒物沉积,肺间质可见吞噬炭黑颗粒的巨噬细胞,且高剂量组炭黑颗粒沉积更多,肺组织纤毛被破坏、肺泡壁结构紊乱、肺间隔增厚、可见充血、炎细胞浸润等病理改变;低、高剂量小鼠肺组织损伤病理评分分别为6.63±1.13和9.8±0.38,明显高于对照组1.66±0.55。高剂量组小鼠脾淋巴细胞略有增多,其余脏器未发现明显异常;纤维蛋白染色可见高剂量组肺间质及支气管外周沉积了大量的纤维蛋白;tunel细胞凋亡结果可见,各剂量组小鼠肺间质、肺泡腔及支气管腔内均可见棕黄色阳性细胞,高剂量组阳性细胞表达数目更多;透射电镜结果显示,对照组肺组织视野清晰,细胞器完整;低、高剂量组肺组织巨噬细胞内可见吞噬大量炭黑颗粒的囊状物,且初、次级溶酶体增多,肺ii型上皮细胞体积增大,线粒体增多。低、高剂量组肺泡灌洗液中总细胞数、淋巴细胞数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数也明显多于对照组。2、低、高剂量组肺组织细胞中ros活性分别是对照组的2.12和3.69倍(p0.01),而肺组织cat活性分别比对照组降低了33.66%和30.94%(p0.01);高剂量组肺组织sod活性和gsh-px活性明显高于对照组和低剂量组(p0.05)。小鼠吸入暴露炭黑颗粒28d后,染毒组小鼠肺组织baxmrna的表达水平明显高于对照组(P0.05),高剂量组Caspase-3、Caspase-7、PARP-1 mRNA的表达水平明显高于对照组和低剂量染毒组(P0.05),Caspase-8和Caspase-9 mRNA明显高于对照组(P0.05),各组小鼠Bcl-2和Fas mRNA的表达没有显著差异;各组小鼠肺组织Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP-1蛋白的表达随染毒剂量的增加而呈上升趋势,且染毒组明显高于对照组(P0.05),Bcl-2蛋白在各组小鼠中的表达无明显变化;免疫组化染色结果显示,各蛋白在染毒组内均有大量阳性细胞表达,明显多于对照组,且多集中在炭黑颗粒沉积的部位。结论:1、28 d连续吸入染毒纳米级炭黑气溶胶主要引发肺组织损伤,为后续开展纳米级炭黑颗粒肺毒性研究提供较为理想的模型和可靠的分析手段。2、长期吸入纳米级炭黑可引起小鼠肺组织氧化损伤和细胞凋亡,氧化应激反应可能是炭黑诱导肺细胞凋亡损伤的机制。内源性线粒体凋亡通路在炭黑颗粒引起的细胞凋亡损伤中扮演着重要的角色。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R114

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