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《山西医科大学》 2018年
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基于JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路探讨环磷酰胺联合甲氨蝶呤抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RANKL表达的研究

牛红青  
【摘要】:背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种滑膜细胞炎性增生、血管翳形成并侵蚀破坏软骨和骨的自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)是RA病变关节中血管翳和软骨连接处最常见的细胞类型。FLS通过产生细胞因子、趋化因子和基质降解分子,迁移至关节软骨处并侵蚀软骨和骨,导致受累关节组织结构破坏,引起关节功能障碍。在白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-17、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎性因子的激发下,RA-FLS表达核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)增多,RANKL与破骨细胞前体细胞表面的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)特异结合,促进破骨细胞前体细胞的发育分化及成熟破骨细胞的活性,最终引起关节骨质侵蚀破坏。早期诊断、早期联合改善病情抗风湿药物(DMARDs)治疗对有效控制RA患者受累关节骨破坏、降低疾病活动度、减少病情反复发作至关重要。甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)是风湿病学界公认的RA治疗的首选药物,大部分RA患者对以MTX为基础的联合治疗反应良好,但仍有约1/3的患者对目前常用的联合治疗方案疗效反应差,仍需探讨新的有效的联合治疗方案。本课题组前期临床研究显示,疾病活动期的RA患者对环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)小剂量与MTX联合治疗疗效明确,且安全性较好。动物实验研究结果表明,CTX联合MTX可抑制胶原诱导性关节炎动物模型中炎性细胞因子的产生,调控树突状细胞、调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)的数量和功能,恢复致炎与抗炎细胞之间的平衡。本研究采用体外实验,旨在探讨CTX的体外活性形式——4-过氧氢环磷酰胺(4-hydroperoxy cyclophosphamide,4-H-CTX)联合MTX对RA-FLS表达RANKL的抑制作用,以及两者联合作用的信号转导机制。目的:探讨CTX联合MTX对RA-FLS表达RANKL的抑制作用以及两者联合作用的信号转导机制。采用体外实验的方法,应用IL-6与可溶性IL-6受体(sIL-6R)复合物刺激RA-FLS活化,检测RA-FLS细胞RANKL的表达水平,并分析CTX、MTX以及两者联合应用对IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达的影响;探讨JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路在IL-6/s IL-6R介导的RA-FLS上调表达RANKL中的作用,并分析CTX联合MTX是否通过JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路抑制了RANKL的表达。方法:获取6例确诊的活动期RA患者的膝关节滑膜组织,建立RA-FLS体外细胞培养体系,细胞培养至第4~6代用于实验研究。本研究分为两部分。第一部分:环磷酰胺联合甲氨蝶呤抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达上调应用IL-6/sIL-6R复合物刺激RA-FLS活化,检测RA-FLS细胞RANKL的表达水平,并分析CTX、MTX以及两者联合应用对IL-6/sIL-6R激发的RANKL表达的抑制作用。(1)应用流式细胞术和光镜下观察细胞形态对所培养的RA-FLS进行鉴定;(2)不同浓度的IL-6/sIL-6R复合物对RA-FLS表达RANKL的影响:应用不同浓度的IL-6/sIL-6R(0,10,25,50,100,200 ng/ml)与RA-FLS共同培养,检测RANKL表达水平,明确IL-6/sIL-6R刺激RA-FLS活化并表达RANKL的作用,并探讨实验最适合的IL-6/sIL-6R刺激浓度;(3)确定合适的CTX、MTX孵育浓度,应用MTT法分析该孵育浓度对RA-FLS细胞活性的影响;(4)CTX、MTX以及两者联合应用对RA-FLS表达RANKL的影响:实验分为5组(空白对照组、IL-6/sIL-6R阳性对照组、CTX组、MTX组、CTX联合MTX组),应用蛋白印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和细胞免疫荧光观察CTX联合MTX对RANKL表达的抑制作用。第二部分:环磷酰胺联合甲氨蝶呤调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RANKL表达的信号转导通路机制研究探讨IL-6/sIL-6R介导的RA-FLS上调表达RANKL是否通过JAK2/STAT3和/或p38MAPK信号通路,以及CTX联合MTX是否通过JAK2/STAT3和/或p38MAPK信号通路抑制了RANKL在RA-FLS的表达。(1)JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路是否调控RA-FLS中IL-6/sIL-6R诱导的RANKL表达上调:实验分为4组(空白对照组、IL-6/sIL-6R阳性对照组、JAK2/STAT3抑制剂AG490组、p38MAPK抑制剂SB203580组),应用蛋白印迹法观察信号通路抑制剂对RANKL以及信号转导蛋白STAT3、p38及其磷酸化蛋白的调控作用。(2)CTX以及MTX对信号转导蛋白的调控作用:实验分为5组(空白对照组、IL-6/sIL-6R阳性对照组、CTX组、MTX组、CTX联合MTX组),应用基于细胞的酶联免疫吸附实验(cell-based ELISA)方法检测信号转导蛋白STAT3、p38及其磷酸化形式p-STAT3、p-p38的表达水平,并同时检测RANKL的表达,分析CTX以及MTX对信号转导蛋白表达的调控作用,阐明CTX联合MTX抑制RA-FLS中RANKL表达的信号转导机制。结果:(1)本课题研究所建立的RA-FLS体外培养方法可靠,光镜下表现为典型的梭形细胞,形态均匀;流式直方图结果显示,钙黏附蛋白-11的荧光强度明显高于同型对照,而CD14、HLA-DR抗原的荧光强度与同型对照没有差异,提示所培养的滑膜细胞表达FLS特异性黏附分子——钙黏附蛋白-11,而滑膜巨噬细胞标记分子CD14和HLA-DR表达阴性。结果说明,所培养的滑膜细胞经传代后,已基本去除了滑膜巨噬细胞,纯化为均一性较好的FLS。(2)不同的IL-6/sIL-6R孵育浓度及不同孵育时间的实验结果表明,IL-6/sIL-6R孵育浓度为100 ng/ml时,RANKL mRNA的表达水平最高;RA-FLS与IL-6/sIL-6R共同孵育培养至72~96 h,RANKL mRNA的高水平表达维持在比较稳定的状态。MTT实验结果表明,4-H-CTX(1μg/ml)和/或MTX(100 nM)与RA-FLS共培养,在孵育时间为72 h时对RA-FLS细胞活力无明显影响。故采用上述的药物浓度及孵育时间进行后续实验。(3)IL-6/sIL-6R复合物可介导RA-FLS表达RANKL增多。与空白对照组相比,IL-6/sIL-6R组的RANKL m RNA表达增多,RANKL蛋白合成增加;细胞免疫荧光分析显示,IL-6/sIL-6R组FLS中的绿色荧光较空白对照组明显增强;上述结果提示,给予IL-6/sIL-6R刺激后,FLS的RANKL表达明显增加。(4)实时荧光定量PCR检测结果显示,给予CTX和/或MTX干预后,RANKL mRNA的表达明显降低,与IL-6/s IL-6R组比较差异有统计学意义(P0.01);OPG mRNA的表达较IL-6/sIL-6R组增高,差异有统计学意义(P0.05)。CTX+MTX联合用药组RANKL mRNA的表达较CTX及MTX单用药组均明显降低,差异均有统计学意义(P0.05),OPG mRNA的表达较MTX单用药组增高,差异有统计学意义(P0.05)。析因设计的方差分析结果显示,CTX和MTX对RANKL mRNA表达的影响有交互作用(F=33.932,P0.001),两者联合应用可协同抑制RA-FLS表达RANKL mRNA。蛋白印迹法结果表明,CTX或MTX干预后,RANKL蛋白的表达水平有降低趋势;CTX+MTX联合用药组RANKL蛋白的表达较IL-6/sIL-6R组显著下降,差异有统计学意义(P0.01),同时,联合用药组RANKL蛋白的表达低于CTX或MTX单用药组(P0.05)。CTX和/或MTX干预后,OPG蛋白的表达较IL-6/sIL-6R组增高,但仅联合用药组OPG蛋白的表达与IL-6/sIL-6R组差异有统计学意义(P0.05)。析因设计的方差分析结果显示,CTX和MTX可协同抑制RANKL蛋白的表达,两药联合应用存在交互作用(F=16.265,P0.001)。细胞免疫荧光分析结果显示,给予药物干预后,CTX组、MTX组、CTX+MTX联合组的荧光明显减弱,其中,CTX+MTX联合组的荧光强度最低。(5)胞内信号转导机制的研究结果表明,IL-6/sIL-6R可增加FLS中信号蛋白STAT3和p38的磷酸化水平,即p-STAT3和p-p38蛋白表达增加,同时RANKL蛋白的表达也明显上调(P均0.01)。给予通路抑制剂AG490、SB203580后,p-STAT3、p-p38蛋白表达下降,同时RANKL表达下调(P均0.01)。Cell-based ELISA方法分析结果显示,IL-6/sIL-6R复合物刺激可上调增加FLS中信号蛋白p-STAT3和p-p38表达,同时RANKL蛋白的表达也明显上调,差异均有统计学意义(P0.01或P0.05)。给予CTX或MTX干预后,p-STAT3和p-p38蛋白表达水平较IL-6/sIL-6R组明显降低,差异有统计学意义(P0.01或P0.05),同时,RANKL的表达降低(P0.01),且CTX+MTX联合组的抑制作用最强。析因设计的方差分析结果显示,CTX和MTX对RANKL和p-STAT3蛋白表达的影响有交互作用(F=57.871,P0.001;F=16.477,P=0.001),两药联合应用可协同降低RANKL和p-STAT3蛋白的表达。对磷酸化p38表达的抑制作用以CTX最为显著(F=43.602,P0.001)。结论:(1)IL-6/sIL-6R复合物可诱导RA-FLS上调表达RANKL;(2)CTX以及MTX均可抑制RA-FLS中IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达;(3)IL-6/sIL-6R复合物刺激RA-FLS上调表达RANKL过程中需要STAT3和p38MAPK信号蛋白磷酸化活化;(4)CTX联合MTX通过调控JAK2/STAT3和p38MAPK信号通路,进而抑制RA-FLS中IL-6/sIL-6R介导的RANKL表达上调。(5)CTX和MTX可协同抑制RANKL和p-STAT3的表达,对p-p38表达的抑制作用以CTX作用最显著。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R593.22

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