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《山西医科大学》 2018年
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MDSCs与CXCR4/CXCL12轴在非酒精性脂肪性肝炎小鼠中的作用及其机制研究

李宁  
【摘要】:第一部分构建CDAA饮食诱导的小鼠NASH模型目的:构建CDAA饮食诱导的NASH小鼠模型,为进一步的深入研究做基础。方法:选用6-8周龄雄性SPF级C57BL小鼠,经适应性喂养1周后分为正常普通饮食NF组、CDAA模型组、CSAA对照组直到第12周末结束。造模结束时,留取血清检测生化指标:丙氨酸氨基转化酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、血糖(Blood Glucose)、总胆固醇(T-CHO)、总胆红素(TBIL)的水平;肝组织经石蜡包埋HE染色,镜下观察小鼠肝组织病理变化,天狼猩红染色评价NASH模型纤维化程度。并应用NAFLD活动度积分(NAFLD activity score,NAS)评分判断NASH模型程度;ELISA方法检测正常组、对照组、模型组外周血炎性因子PGE2、IL-6、INF-γ水平。结果:(1)经纯化CDAA模型饮食、CSAA对照饮食组喂养小鼠12周末其平均体重,肝指数与正常组无显著差异(P0.05)。模型组小鼠肝脏色泽变黄,边缘较钝,质地较硬,弹性差。模型组外周血清ALT、AST、Glucose较正常组均明显升高(P0.001)。而BUN、TG、T-CHO、TBIL水平比较差异无统计学意义(P0.05)。(2)ELISA结果显示CDAA模型饮食小鼠血清炎性因子PGE2、IL-6、INF-γ水平均较正常饮食组升高(P0.001)。(3)HE染色可见CDAA饮食模型组小鼠肝脏细胞镜下满布大颗粒脂滴,可见不同程度的气球样变,炎性细胞。天狼猩红染色病例显示不同程度的纤维化。CDAA模型饮食喂养小鼠12周末NAS评分5分。CSAA对照饮食组喂养12周末小鼠肝脏也呈现出不同程度而脂肪变性,及少许炎细胞浸润,但是NAS评分2-4分。结论:CDAA饮食喂养NASH小鼠模型多项生化指标及肝脏组织学改变符合NASH评判标准,NASH小鼠模型建立成功,可用于进一步的科学研究。第二部分MDSCs在NASH小鼠体内的改变及作用目的:研究证实髓源性抑制性细胞(MDSCs)具有强大的免疫调控功能,但MDSCs在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中所发挥的作用尚不清楚。本研究的目的在于研究NASH疾病过程中小鼠体内MDSCs细胞的分布、变化、功能以及与T细胞亚群的关系。方法:采用流式细胞技术检测正常、对照CSAA、模型CDAA饮食组小鼠外周血T细胞亚群的改变,同时检测各组小鼠体内肝、脾、血液、骨髓中CD11b~+Gr-1~+的MDSCs细胞的比例、亚型改变,分析NASH模型小鼠体内MDSCs细胞整体的变化以及与血清转氨酶ALT、AST的关系,与T细胞亚群的改变之间的关系。体内实验应用磁珠分选技术纯化骨髓来源的Gr-1~(high)Ly-6G~+,Gr-1~(dim)Ly-6G~-MDSCs细胞,CD8+T细胞,并将纯化的Gr-1~(high)Ly-6G~+通过尾静脉注射过继转移入NASH小鼠模型,应用吉西他滨腹腔注射消耗体内MDSCs,并检测肝功能血清学指标及病理染色证实MDSCs在NASH中所起的作用。结果:T细胞亚群检测结果显示NASH模型中CD3+CD8+数量呈下降趋势,存在细胞免疫功能紊乱。外周血液中CD3+CD8+T细胞的比例与外周血ALT、AST水平呈显著负相关(P0.001)。CDAA饮食诱导的小鼠NASH模型骨髓中MDSCs比例(73.68±4.49)较正常组(59.71±4.02)显著升高,具有统计学意义(P0.05)。CDAA模型组的外周血中MDSCs的比例有所下降,但与正常组相比未见明显统计学差异(P0.05)。而NASH模型组肝组织中MDSCs比例较正常组显著降低(P0.001)。NASH病变的程度与MDSCs的比例有一定的关系,NAS7分的病例外周血液中MDSCs的比例大于NAS7分的;而在骨髓中NAS7分的病例MDSCs的比例却小于NAS7分的病例。分析其亚群显示,骨髓中CDAA模型组CD11b~+Gr-1~(high)Ly-6G~+MDSCs的比例(76.67±12.64),CSAA对照组(69.42±13.69)较正常组(2.57±0.93)显著升高。差异具有显著性意义(F=42.152,P0.001)。外周血中MDSCs和CD8+T细胞具有负相关关系(r=-0.701 P=0.024)。NASH小鼠分为对照组(注射PBS)和干预组(注射MDSCs),每组5只。过继转移正常小鼠骨髓来源的Gr-1~(high)Ly-6G~+MDSCs明显降低NASH模型血清AST、ALT水平(P0.001),减轻肝脏病变。NASH小鼠分为对照组(注射生理盐水)和干预组(注射吉西他滨),每组5只。应用吉西他滨消耗体内MDSCs同时不影响体内T细胞亚群的比例,但是对NASH模型血清AST、ALT水平影响无明显统计学意义(P0.05)。结论:CDAA饮食诱导的NASH小鼠模型体内MDSCs数量、亚型及T细胞亚群均呈现出不同程度的改变,对细胞免疫功能特别是CD8+T细胞作用有影响。正常小鼠骨髓来源Gr-1~highigh Ly-6G~+的MDSCs具有缓解NASH病变的作用,应用MDSCs的免疫抑制功能有望作为一种免疫干预的手段应用于NASH治疗。第三部分CXCR4/CXCL12轴在NASH小鼠中作用和对MDSCs迁移的影响目的:第二部分的研究结果说明MDSCs在小鼠NASH过程中扮演了重要的角色,具有抑制免疫,减轻肝脏病理损伤的作用。但是,NASH病变过程中MDSCs的迁移机制尚不清楚。本部分研究目的在于探讨CXCR4、CXCL12在NASH中的改变及CXCR4/CXCL12轴在MDSCs的迁移及肝脏定居中的作用。方法:流式细胞技术检测NASH小鼠血液、骨髓、肝、脾MDSCs细胞上CXCR4受体的表达情况;免疫组织化学技术检测各组肝组织中CXCL12、CXCR4、STAT3、p-STAT3的表达;体外实验应用免疫磁珠技术分离纯化骨髓来源Gr-1~(high)Ly-6G~+的MDSCs细胞,应用Transwell实验检测CXCR4/CXCL12轴对于MDSCs细胞的趋化作用;体内给予CXCR4抑制剂AMD3100抑制CXCR4/CXCL12轴的作用,并应用流式细胞技术检测AMD3100对血液、骨髓中MDSCs的影响,分析AMD3100对血清ALT、AST及NASH病理改变的影响,分析CXCR4/CXCL12轴在体内对NASH病变的作用。结果:流式结果显示,与正常小鼠比较,CSAA对照及NASH模型组小鼠血液、骨髓、肝、脾MDSCs表达CXCR4平均荧光强度(MFI)明显升高,统计结果显示骨髓、肝、脾MDSCs上CXCR4表达水平较正常组差异具有统计学意义(P0.05)。在NASH病变的肝脏组织中CXCL12、CXCR4蛋白的表达明显增加,统计分析显示差异具有统计学意义(P0.05)。STAT3、p-STAT3蛋白在NASH肝组织中的表达明显升高(P0.01)。体外Transwell实验结果证实Gr-1~highigh Ly-6G~+的MDSCs的迁移数量随着CXCL12浓度的升高而增加(P0.05),并且迁移能力受到AMD3100的抑制。体内连续3天给予AMD3100,血液中MDSCs比例较对照生理盐水组明显升高(P0.01),而骨髓中MDSCs比例较对照生理盐水组明显降低(P0.01)。但体内应用AMD3100后NASH病变及ALT、AST水平分析未见明显改变。结论:骨髓Gr-1~highigh Ly-6G~+MDSCs的迁移受到CXCR4/CXCL12通路的调控。NASH肝脏组织中CXCL12、CXCR4表达对MDSCs的定向迁移具有重要的作用。但体内应用特异性的CXCR4抑制剂AMD3100对于NASH病变并无明显作用。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R575.5

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