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《山西医科大学》 2018年
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自噬和长链非编码RNA MEG3对IGFBPrP1激活肝星状细胞的调控及其机制的研究

周玉政  
【摘要】:研究背景:肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是来源于间质的一种肝脏非实质细胞,HSCs的激活是引起肝纤维化发生的关键环节。多种细胞因子参与其活化,其中转化生长因子(transforming growth factor beta1,TGFβ1)发挥着举足轻重的作用,在活化的初期及末期通过直接或间接方式持续激活HSCs,HSCs激活后可使肝脏内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和降解失衡,最终导致肝纤维化。细胞自噬是指细胞在各种因素的作用下,细胞对其内部受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入的病原体进行降解的生物学过程。现已证实,自噬在肝纤维化中发挥重要作用。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一种转录长度超过200核苷酸的RNA,母系表达基因3(materally expressed gene 3,MEG3),是最先发现的具有肿瘤抑制功能的lncRNA,其在肝癌组织中的表达量低于正常组织约200倍,且在肝纤维化中也发挥重要作用。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-related protein 1,IGFBPrP1),是导师课题组十余年来在国家自然科学基金资助下研究发现的一种新致纤维化因子,即它可以激活HSCs,产生过多的ECM,且与TGFβ1可以互相调节互相影响,导致肝纤维化的发生发展。目前已知最强的致肝纤维化因子TGFβ1可诱导肝纤维化形成过程中伴有HSCs自噬的发生,可影响肝纤维化过程中lncRNA MEG3表达。既然IGFBPrP1与TGFβ1之间可以相互调控,那么IGFBPrP1是否也可以像TGFβ1一样诱导HSCs发生自噬,并且影响lncRNA MEG3的表达,从而影响肝纤维化的发生发展,目前国内外尚未见报道,这正是本文要解决的科学问题。自噬受多条信号通路调控,其中PI3K/Akt/mTOR信号通路是主要的调控通路之一,HSCs的激活同样受多种细胞因子和多条信号通路调控。导师课题组前期研究发现IGFBPrP1可能通过PI3K/Akt信号通路发挥致纤维化作用。那么IGFBPrP1是否可以通过引起Akt、mTOR磷酸化,进而调控自噬,从而促进HSCs激活,目前尚不清楚。P53是一种抑癌基因,lncRNA MEG3可通过与P53相互结合,发挥抑癌作用,那么IGFBPrP1、lncRNA MEG3与P53三者关系如何,目前尚未见报道。本文共分六部分,其中第一至第三部分选用大鼠原代HSCs作为研究对象,其原因是由于原代细胞生物性状较稳定,可最大程度反应机体内原始状态。使用腺病毒介导的IGFBPrP1基因转染大鼠原代HSCs,使用自噬促进剂雷帕霉素或抑制剂3MA干预大鼠原代HSCs,研究IGFBPrP1在激活HSCs过程中对自噬的影响及其作用机制。第四至第六部分,选用JS-1(小鼠肝星状细胞株)作为研究对象,其原因是使用JASPAR数据库预测MEG3与P53的结合位点,发现二者在小鼠与人中有结合位点,而在大鼠中无结合位点。使用质粒载体构建的pcDNA3.1-MEG3过表达MEG3,使用针对MEG3设计的shRNA-MEG3基因沉默MEG3表达,研究IGFBPrP1、lncRNA MEG3与P53三者之间的关系。以此阐明自噬和lncRNA MEG3对IGFBPrP1激活HSCs的调控及其机制,为早期诊断及防治肝纤维化寻找有效靶点提供实验依据及理论基础。第一部分IGFBPrP1对大鼠原代肝星状细胞活化及自噬的影响目的:成功分离、鉴定及培养大鼠原代HSCs,判定IGFBPrP1在激活HSCs过程中是否诱导自噬发生。方法:从SD大鼠肝脏分离HSCs,进行鉴定及培养,用于后续实验。首先用不同MOI(10,20,40,80,100)的Ad IGFBPrP1转染大鼠原代HSCs,48 h后计算转染效率,筛选最适MOI,用于后续实验。实验分组如下:正常对照组:使用含有10%FBS培养基培养细胞;CAd组:使用腺病毒空载体转染细胞;饥饿培养组:使用2%FBS培养基培养细胞;Ad IGFBPrP1组:使用AdIGFBPrP1转染细胞24 h后换用2%FBS培养基继续培养,分别于3、6、12、24、48 h后收集细胞。使用透射电镜观察HSCs中自噬超微结构变化;MDC染色法检测HSCs中自噬溶酶体的表达;细胞免疫荧光法检测HSCs中LC3B的表达;RT-qPCR方法检测HSCs中IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、LC3B的mRNA表达;western blot检测IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62蛋白表达。结果:(1)细胞得率约为3-4×10~7/只,台盼蓝染色细胞存活率大于80%。荧光显微镜下自发绿色荧光的细胞比例大于80%。(2)细胞24 h贴壁,72 h开始融合增殖,形状呈不规则,7天后,细胞形态逐渐变长,部分呈纤维片状聚集。(3)细胞免疫组化desmin及α-SMA阳性率大于80%。(4)倒置荧光显微镜观察不同梯度MOI指数,MOI 80时转染效率最高,且对细胞形态活力影响较小。(5)AdIGFBPrP1转染大鼠原代HSCs后IGFBPrP1和TGFβ1的表达:IGFBPrP1蛋白与mRNA表达随时间延长逐渐增多,24 h最高,其后开始下降,差异有统计学意义(P0.05)。TGFβ1蛋白与mRNA表达随时间增加而逐渐增多,差异有统计学意义(P0.05)。(6)AdIGFBPrP1转染大鼠原代HSCs后α-SMA和collagen I的表达:α-SMA和collagen I蛋白与mRNA表达随时间增加逐渐增多,差异有统计学意义(P0.05)。(7)AdIGFBPrP1转染大鼠原代HSCs后LC3B、Beclin1和SQSTM1/p62的表达:LC3B蛋白与mRNA表达从3 h开始升高,12 h达到最高,其后开始下降,差异有统计学意义(P0.05),免疫荧光可见LC3B蛋白绿色荧光强度增强。Beclin1蛋白表达在12 h达到最高值,差异有统计学意义(P0.05)。SQSTM1/p62蛋白表达变化与Beclin1、LC3B呈相反趋势,差异有统计学意义(P0.05)。(8)MDC染色检测AdIGFBPrP1转染大鼠原代HSCs后自噬溶酶体的变化:亮点状颗粒明显增多。(9)透射电镜观察AdIGFBPrP1转染大鼠原代HSCs后超微形态结构变化:细胞内可见大量双层膜囊泡,部分囊泡内包裹细胞器如线粒体等,部分囊泡与溶酶体结合形成自噬溶酶体。结论:成功分离、鉴定及培养了大鼠原代HSCs;IGFBPrP1能够诱导HSCs发生自噬,促进TGFβ1持续表达,从而激活HSCs,使ECM合成增多。第二部分自噬促进剂或抑制剂对AdIGFBPrP1转染大鼠原代肝星状细胞自噬与活化的影响目的:明确改变自噬量是否会影响IGFBPrP1对HSCs的激活程度。方法:(1)筛选雷帕霉素最佳干预浓度与时间,实验分组如下:正常组:用含10%FBS的培养基培养细胞;雷帕霉素低浓度组:用含25nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基培养细胞;雷帕霉素中浓度组:用含50nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基培养细胞;雷帕霉素高浓度组:用含100nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基培养细胞,分别培养6 h、12 h、24 h后收集细胞。(2)使用雷帕霉素与Ad IGFBPrP1共同干预HSCs,实验分组如下:正常组:用含10%FBS培养基培养细胞;Ad IGFBPrP1组:用含MOI 80 Ad IGFBPrP1病毒的2%FBS培养基培养细胞;雷帕霉素组:用含100nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基培养细胞;Ad IGFBPrP1+雷帕霉素组:用MOI 80的AdIGFBPrP1转染细胞24 h后,换用含100nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基培养细胞,24 h后收集细胞。(3)筛选3MA最佳干预浓度与时间,实验分组如下:正常组:用含10%FBS的培养基培养细胞;3MA低浓度组:用含2.5mmol/L 3MA的2%FBS培养基培养细胞;3MA中浓度组:用含5.0mmol/L 3MA的2%FBS培养基培养细胞;3MA高浓度组:用含10.0mmol/L 3MA的2%FBS培养基培养细胞,分别培养6 h、12 h、24 h后收集细胞。(4)使用3MA与AdIGFBPrP 1共同干预HSCs,实验分组如下:正常组:用含10%FBS的培养基培养细胞;Ad IGFBPrP1组:用含MOI 80 AdIGFBPrP1病毒的2%FBS培养基培养细胞;3MA组:用含10.0mmol/L 3MA的2%FBS培养基培养细胞;Ad IGFBPrP1+3MA组:用MOI 80的AdIGFBPrP1转染细胞24 h后,换用含10.0nmol/L 3MA的2%FBS培养基培养细胞,24 h后收集细胞。RT-qPCR方法检测HSCs中IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、LC3B的mRNA表达;Western blot检测IGFBPrP1、TGFβ1、α-SMA、collagen I、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、蛋白表达;免疫荧光法检测HSCs中LC3B的表达;MDC染色法检测HSCs中自噬溶酶体的表达。结果:(1)选取不同浓度雷帕霉素与HSCs共同培养不同时间,浓度为100nmol/L的雷帕霉素处理24 h后对HSCs的自噬促进作用最强。(2)AdIGFBPrP1与雷帕霉素共同干预HSCs后LC3B、Beclin1和SQSTM1/p62的表达变化:共同干预组LC3B mRNA及蛋白水平均显著升高,细胞免疫荧光中可见大量绿色荧光斑点弥散分布于胞浆内;Beclin1蛋白表达增多;SQSTM1/p62蛋白表达减少,差异有统计学意义(P0.05)。(3)MDC染色检测AdIGFBPrP1与雷帕霉素共同干预HSCs后自噬溶酶体的变化:共同干预组的亮点状颗粒表达最多。(4)AdIGFBPrP1与雷帕霉素共同干预HSCs后IGFBPrP1和TGFβ1的表达变化:共同干预组IGFBPrP1与TGFβ1蛋白与mRNA表达显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。(5)AdIGFBPrP1与雷帕霉素共同干预HSCs后α-SMA和collagen I的表达变化:共同干预组α-SMA和collagen I蛋白及mRNA表达显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。(6)选取不同浓度3MA与HSCs共同培养不同时间,浓度为10.0mmol/L的3MA处理24 h后对HSCs的自噬抑制作用最强。(7)Ad IGFBPrP1与3MA共同干预HSCs后LC3B、Beclin1和SQSTM1/p62的表达变化:共同干预组LC3B mRNA及蛋白表达降低,细胞免疫荧光中绿色荧光强度减弱;Beclin1蛋白表达降低;SQSTM1/p62蛋白的表达则明显增高,差异有统计学意义(P0.05)。(8)MDC染色检测AdIGFBPrP1与3MA共同干预HSCs后自噬溶酶体的变化:共同干预组亮点状颗粒减少。(9)AdIGFBPrP1与3MA共同干预HSCs后IGFBPrP1和TGFβ1的表达变化:共同干预组IGFBPrP1和TGFβ1蛋白及mRNA表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。(10)AdIGFBPrP1与3MA共同干预HSCs后α-SMA和collagen I的表达变化:共同干预组α-SMA和collagen I蛋白及mRNA表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:增加自噬可促进AdIGFBPrP1激活HSCs、合成ECM增多;减少自噬可抑制AdIGFBPrP1激活HSCs、合成ECM减少。第三部分PI3K/Akt/mTOR信号通路在AdIGFBPr P1转染大鼠原代肝星状细胞中的变化及意义目的:明确PI3K/Akt/mTOR信号通路在IGFBPrP1诱导的HSCs自噬与活化中的作用。方法:使用MOI 80的AdIGFBPrP1、雷帕霉素与3MA干预HSCs。实验分组如下:正常对照组:使用含有10%FBS培养基培养细胞;AdIGFBPrP1组:使用Ad IGFBPrP1转染细胞24 h后,换用含2%FBS培养基继续进行培养;雷帕霉素组:使用含有终浓度100nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基培养;AdIGFBPrP1+雷帕霉素组:使用AdIGFBPrP1转染细胞24 h后,换用含有100nmol/L雷帕霉素的2%FBS培养基继续培养;3MA组:使用含有终浓度10.0mmol/L 3MA的2%FBS培养基培养;Ad IGFBPrP1+3MA组:使用AdIGFBPrP1转染细胞24 h后,换用含有终浓度10.0mmol/L 3MA的2%FBS培养基继续培养,24 h后收集细胞。Western blot检测Akt、pAkt、mTOR、pmTOR蛋白表达。结果:Ad IGFBPrP1转染HSCs后可抑制Akt和mTOR的磷酸化水平,雷帕霉素与3MA共同干预后可进一步加强Ad IGFBPrP1的抑制作用,差异有统计学意义(P0.05)。结论:IGFBPrP1可通过下调HSCs中Akt与mTOR磷酸化水平促进自噬。第四部分LncRNA MEG3在AdIGFBPr P1转染的JS-1(小鼠肝星状细胞株)中表达变化及意义目的:明确AdIGFBPrP1转染JS-1(小鼠肝星状细胞株)后lncRNA MEG3表达的变化特点。方法:首先用不同MOI(10,50,100,200)的Ad IGFBPrP1转染JS-1(小鼠肝星状细胞株),48 h后使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,计算转染效率,筛选出最适MOI,用于后续实验。确定AdIGFBPrP1的最适MOI后,用最适MOI转染JS-1(小鼠肝星状细胞株),进行后续实验。实验分组如下:正常组:用含10%FBS培养基培养细胞;CAd组:用腺病毒空载体病毒转染细胞;AdIGFBPrP1组:用AdIGFBPrP1转染细胞24 h后,换用2%FBS培养基培养,分别于3 h、6h、12 h、24 h后收集细胞。RT-qPCR方法检测JS-1(小鼠肝星状细胞株)中IGFBPrP1、MEG3的RNA表达变化。结果:(1)倒置荧光显微镜观察不同梯度MOI指数,MOI 100时转染效率最高,且对细胞形态活力影响较小。(2)AdIGFBPrP1转染JS-1(小鼠肝星状细胞株)后,RT-qPCR检测IGFBPrP1与MEG3 RNA的表达变化:IGFBPrP1的mRNA表达随着作用时间延长逐渐增多。MEG3的表达随时间延长逐渐减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论:在AdIGFBPrP1转染的HSCs中,随着IGFBPrP1 mRNA表达水平逐渐上调,则MEG3 RNA的表达逐渐下调。第五部分上调或下调lncRNA MEG3对AdIGFBPrP1诱导的JS-1(小鼠肝星状细胞株)自噬影响及意义目的:明确上调或下调MEG3表达后如何影响IGFBPrP1诱导的JS-1(小鼠肝星状细胞株)的自噬。方法:使用AdIGFBPrP1、pcDNA3.1-MEG3、shRNA-MEG3转染JS-1(小鼠肝星状细胞株)。实验分组如下:正常对照组:使用含有10%FBS的培养基培养;pcDNA3.1-MEG3+CAd组:转染pcDNA3.1-MEG3 6 h后换用含有CAdIGFBPrP1的2%FBS培养基培养;pcDNA3.1-control+AdIGFBPrP1组:转染pcDNA3.1-control 6 h后换用含有MOI 100 AdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;pcDNA3.1-MEG3+Ad IGFBPrP1组:转染pcDNA3.1-MEG3 6 h后换用含有MOI 100 Ad IGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;shRNA-MEG3+CAd组:转染shRNA-MEG3 6 h后换用含有CAdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;shRNA-NC+AdIGFBPrP1组:转染shRNA-NC 6 h后换用含有MOI 100Ad IGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;shRNA-MEG3+AdIGFBPrP1组:转染shRNA-MEG3 6 h后换用含有MOI 100 AdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养,24 h后收集细胞。RT-qPCR方法检测MEG3、IGFBPrP1、TGFβ1、LC3B、α-SMA mRNA表达;Western blot检测IGFBPrP1、TGFβ1、LC3B、Beclin1、SQSTM1/p62、α-SMA、collagen I蛋白表达;免疫荧光法检测HSCs中LC3B的表达;MDC染色法检测HSCs中自噬溶酶体的表达。结果:(1)pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组lncRNA MEG3表达变化:MEG3表达增高,但表达水平低于pcDNA3.1-MEG3单独转染组,差异有统计学意义(P0.05)。(2)pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组LC3B、Beclin1和SQSTM1/p62表达变化:共同干预组AdIGFBPrP1所引起的LC3B蛋白与mRNA表达降低,细胞免疫荧光中绿色荧光强度减弱,Beclin1蛋白表达降低,SQSTM1/p62蛋白表达增高,差异有统计学意义(P0.05)。(3)MDC染色法检测pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组自噬溶酶体表达变化:共同干预组亮点状颗粒减少。(4)pcDNA3.1-MEG3与Ad IGFBPrP1共同转染组IGFBPrP1和TGFβ1表达变化:共同转染组Ad IGFBPrP1所引起的IGFBPrP1和TGFβ1蛋白及mRNA表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。(5)pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组α-SMA和collagen I表达变化:共同干预组AdIGFBPrP1所引起的α-SMA蛋白及mRNA表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。(6)shRNA-MEG3干扰效率筛选:使用shRNA构建合成三条lncRNA MEG3的干扰序列转染JS-1(小鼠肝星状细胞株),作用48 h后,使用RT-qPCR检测MEG3的表达,shRNA-MEG3(3678)干扰效率最高。(7)shRNA-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组lncRNA MEG3表达变化:共同转染组较之shRNA-MEG3单独转染组MEG3 RNA水平进一步降低,差异有统计学意义(P0.05)。(8)shRNA-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组LC3B、Beclin1和SQSTM1/p62的表达变化:共同转染组可明显促进LC3B表达,细胞免疫荧光中绿色荧光强度增强,Beclin1表达增加,SQSTM1/p62蛋白表达减少,差异有统计学意义(P0.05)。(9)MDC染色法检测shRNA-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组自噬溶酶体表达变化:共同转染组亮点状颗粒增多。(10)shRNA-MEG3与Ad IGFBPrP1共同转染组IGFBPrP1和TGFβ1表达变化:共同转染组IGFBPrP1和TGFβ1蛋白及mRNA表达增高,差异有统计学意义(P0.05)。(11)shRNA-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组α-SMA和collagen I表达变化:共同转染组α-SMA和collagen I蛋白及mRNA表达增高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:lncRNA MEG3可抑制AdIGFBPrP1诱导的HSCs自噬。第六部分LncRNA MEG3调控转录因子P53对AdIGFBPrP1转染JS-1(小鼠肝星状细胞株)自噬的影响目的:探索Ad IGFBPrP1转染JS-1(小鼠肝星状细胞株)后,lncRNA MEG3是否通过P53影响其自噬。方法:使用AdIGFBPrP1、pcDNA3.1-MEG3、shRNA-MEG3转染JS-1(小鼠肝星状细胞株)。实验分组如下:正常对照组:使用含有10%FBS的培养基培养;pcDNA3.1-MEG3+CAd组:转染pcDNA3.1-MEG3 6 h后换用含有CAdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;pcDNA3.1-control+Ad IGFBPrP1组:转染pcDNA3.1-control 6 h后换用含有MOI 100 AdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;pcDNA3.1-MEG3+Ad IGFBPrP1组:转染pcDNA3.1-MEG3 6 h后换用含有MOI 100 Ad IGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;shRNA-MEG3+CAd组:转染shRNA-MEG3 6 h后换用含有CAdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;shRNA-NC+AdIGFBPrP1组:转染shRNA-NC 6 h后换用含有MOI 100Ad IGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养;shRNA-MEG3+AdIGFBPrP1组:转染shRNA-MEG3 6 h后换用含有MOI 100 AdIGFBPrP1的2%FBS培养基继续培养,24 h后收集细胞。RT-qPCR检测P53 mRNA表达,western blot检测P53蛋白表达,细胞免疫荧光检测P53表达及细胞定位,双荧光素酶报告基因技术检测lncRNA MEG3与转录因子P53是否相互作用。结果:(1)pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组转录因子P53的表达变化:共同转染组P53表达较之AdIGFBPrP1组增多,差异有统计学意义(P0.05)。(2)细胞免疫荧光检测pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组P53蛋白的定位及表达变化:共同转染组红色荧光标记的P53蛋白荧光强度明显增强,大量红色荧光分布于细胞质中。(3)双荧光素酶报告基因技术检测pcDNA3.1-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组P53转录活性的变化:共同转染组的荧光素酶活性水平显著增加。(4)shRNA-MEG3转染组转录因子P53的表达变化:共同转染组中,P53的表达较之AdIGFBPrP1单独转染减少,差异有统计学意义(P0.05)。(5)细胞免疫荧光检测shRNA-MEG3与AdIGFBPrP1共同转染组P53蛋白的定位及表达变化:基因沉默MEG3后,P53红色荧光强度明显减弱,红色荧光多分布于细胞质中。结论:IGFBPrP1转染HSCs后,lncRNA MEG3通过与P53相互作用,增强P53转录活性,促进P53表达,从而对HSCs自噬产生影响。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R575

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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张毓川;自噬负性调控CD8~+T淋巴细胞的活化和功能[D];浙江大学;2018年
2 王静超;自噬调节细胞凋亡的机制研究[D];浙江大学;2018年
3 郝艳琴;自噬调节氧化应激条件下人脐静脉内皮细胞的功能及其机制研究[D];南昌大学;2018年
4 赖华毅;鼠伤寒沙门氏菌spvB基因对宿主细胞自噬的影响及其分子机制的研究[D];南昌大学;2018年
5 陈鹏;环氧合酶2(COX-2)对Cr(Ⅵ)致DF-1内质网自噬的调控研究[D];山东农业大学;2018年
6 胡旭瑞;基于自噬水平研究X射线对成骨细胞的作用[D];兰州大学;2018年
7 周净;当归有效部位调节人脐静脉内皮细胞自噬抗动脉粥样硬化研究[D];兰州大学;2018年
8 刘浪;自噬在辐射诱导小鼠肝损伤中的作用及机制研究[D];贵州医科大学;2018年
9 尚波;同型半胱氨酸诱导细胞线粒体自噬障碍的实验研究[D];南京医科大学;2017年
10 徐志飞;苏尼替尼诱导p53自噬—溶酶体降解的调控机制及其生物学效应[D];浙江大学;2016年
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