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《山西医科大学》 2018年
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POSTN蛋白在膝骨关节炎发生进展中的作用及分子机制研究

王小健  
【摘要】:研究背景膝关节骨关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是一种严重危害中老年人健康的关节退行性疾病。该疾患病因目前仍未明确,目前认为OA是由于在力学和生物学因素的共同作用下,导致软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨三者的动态降解和合成的正常偶联失衡之结果。已有文献证实:膝关节的退变首先源于关节软骨的退变。POSTN(periostin)蛋白首先是在小鼠成骨细胞系中发现的一种细胞外基质蛋白,又称骨膜蛋白,原始功能可促进成骨及其前体细胞在骨膜的聚集分化,后发现其在多种人体组织中都有表达。已有研究显示膝关节OA发生时关节软骨组织中POSTN mRNA的表达明显增高,证明POSTN mRNA的表达与膝关节OA的发生密切相关。因此我们推测膝关节软骨组织和关节液中可能有POSTN蛋白的存在,其浓度的变化可能与膝关节OA的发生发展有一定的关联。本实验首先通过检测POSTN蛋白在膝OA不同阶段患者软骨组织、关节液中的表达情况,其次体外分离培养人膝胫骨平台软骨细胞进行细胞部分实验,最后建立动物OA模型进行体内验证,观测POSTN蛋白对膝软骨组织及细胞的影响,从而探讨POSTN蛋白浓度变化与膝OA病情严重程度之间的关系,并进一步探讨其作用机制。研究目的:1.观测膝OA不同阶段人群关节软骨组织中、关节液中POSTN蛋白的表达情况;2.体外分离培养人膝关节胫骨平台软骨细胞,观测POSTN蛋白对人膝软骨细胞的作用(保护、增殖、早期凋亡、分化)并探讨其作用机制;3.构建模拟膝OA的大鼠动物模型,关节腔注射POSTN蛋白等不同试剂,观测POSTN蛋白对膝OA发生进展的影响。研究方法:1.检测正常人群及膝OA不同阶段人群关节软骨组织、关节液标本中POSTN蛋白的表达情况;2.体外分离培养正常人膝胫骨平台软骨细胞,进行下列研究:(1)POSTN蛋白对软骨细胞正性保护作用的研究------a.软骨细胞培养液中添加POSTN蛋白、PBS、抗POSTN蛋白抗体b.采用lipo2000运载POSTN mRNA质粒转染软骨细胞、并使用空载体对照c.使用Flexcell加压培养海藻酸钠+软骨细胞盘,并使用非加压组对照d.在细胞培养液中分别添加抗POSTN蛋白抗体、抗体+Wnt-β通路抑制剂、PBS(2)POSTN蛋白对软骨细胞增殖作用的研究------a.培养液中添加POSTN蛋白、PBS、抗POSTN蛋白抗体,使用EDU技术观测软骨细胞24h、48h、72h增殖率b.使用PCR技术检测软骨细胞内Notch信号通路的4个受体Notch1 mRNA、Notch2mRNA、Notch3 mRNA、Notch4 mRNA及3个配体Jagged1mRNA、Jagged2 mRNA、Dll mRNA的表达情况c.利用大鼠膝OA模型及EDU技术观测关节腔注射POSTN蛋白对胫骨平台软骨细胞增殖的影响d.大鼠乳鼠、幼鼠阶段胫骨近端骺软骨细胞中POSTN蛋白的表达情况(3)POSTN蛋白抑制软骨细胞早期凋亡的研究------a.应用硝普钠(SNP)建立诱导软骨细胞凋亡模型,使用流式细胞仪和AV-PI法检测6h、12h、24h、48h软骨细胞早期凋亡率b.使用PCR、免疫荧光技术检测POSTN与iNOS在mRNA和蛋白层面的表达情况(4)POSTN影响软骨细胞表型分化的研究------a.POSTN mRNA表达对软骨细胞表型分化基因表达的影响b.POSTN蛋白对软骨细胞分化相关基因转录调控的研究3.动物实验部分:(1)SD大鼠60只,分为两组,假手术对照组和OA模型组,假手术组只实施切开缝合术,OA模型组随机切断一侧前交叉韧带。于术后1w、2w、4w、8w、12w检测两组大鼠关节盥洗液中POSTN蛋白的表达情况(2)SD大鼠90只,平均分为5组:假手术对照组,生理盐水注射组,低浓度POSTN蛋白注射组,高浓度POSTN蛋白注射组,POSTN蛋白抗体注射组。假手术对照组单纯行手术切开,余4组全部制作一侧前交叉韧带切断模型。于术后3d、1w、2w、4w向大鼠膝关节腔内注射相应试剂。术后4w行关节荧光分子断层成像(Fluorescence Molecular Tomography,FMT)检测,术后12w施术关节行X线检测后处死大鼠,部分标本行膝胫骨平台印度墨水染色、番红O染色、软骨渗透实验,部分标本取材、使用免疫组化技术检测膝关节软骨组织中POSTN、CollagenⅡ、MMP13的表达情况。结果:1.POSTN蛋白在正常膝和OA早期膝软骨组织中表达较高,OA晚期表达降低。在正常膝关节液中表达较低,而在膝关节OA早期及中期表达较高,OA晚期降低(p0.05);2.细胞体外实验结果(1)POSTN蛋白对软骨细胞正性保护作用的研究------培养液中添加POSTN蛋白可增加软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达、减少β-catenin蛋白的表达(p0.05);软骨细胞内过表达POSTN蛋白可促进Ⅱ型胶原的表达、减少β-catenin蛋白的表达(p0.05);加压培养软骨细胞后,细胞内POSTN蛋白表达增多,Ⅱ型胶原的表达较非加压组减少、β-catenin蛋白表达增多(p0.05);使用Wnt-β通路抑制剂干预抗POSTN蛋白抗体培养软骨细胞可以减少抗POSTN蛋白抗体对软骨细胞培养的负性作用(p0.05)(2)POSTN蛋白对软骨细胞增殖作用的研究------24h时POSTN组和PBS组细胞增殖率较抗POSTN组高(p0.05),48h时POSTN组细胞增殖率较其它两组高(p0.05),72h时POSTN组细胞增殖率最高、PBS组居中、抗POSTN蛋白组最低(p0.05)。人膝软骨细胞中只有Notch1受体和Jagged1配体的表达,POSTN蛋白是与Jagged1配体直接结合后再与Notch1受体结合来激活Notch增殖通路的。POSTN蛋白注射组大鼠内侧胫骨平台软骨增殖率较PBS注射组、抗POSTN蛋白组高(p0.05),PBS注射组较抗POSTN蛋白注射组软骨细胞增殖率高(p0.05)。0周龄、1周龄、2周龄大鼠骺软骨增殖区软骨细胞中POSTN蛋白表达阳性率高(3)POSTN蛋白抑制软骨细胞早期凋亡的研究------SNP产生的NO途径可以造成软骨细胞早期凋亡的模型,培养液中添加POSTN蛋白可以在添加SNP后6h、12h、24h抑制软骨细胞的早期凋亡。软骨细胞在贴壁培养后24h、48h,实验组软骨细胞POSTN mRNA、iNOS mRNA表达均较对照组增高(p0.05);72h,POSTN mRNA表达与对照组差别无统计学意义,而iNOS mRNA表达明显增高。实验组软骨细胞24h、48h POSTN蛋白荧光强度较对照组增强、iNOS荧光强度较对照组无明显差别,72h POSTN蛋白荧光强度基本同对照组、iNOS荧光强度较对照组明显增强。(4)POSTN影响软骨细胞表型分化的研究------转染POSTN mRNA后人软骨细胞表达POSTN mRNA、Aggrecan mRNA、CollagenⅡmRNA表达量相对增高(p0.05),而Runx2 mRNA、MMP13 mRNA相对表达量较低(p0.05),Sox9 mRNA相对表达量两组间比较无统计学差异(p0.05)。敲减POSTN mRNA后得到的结果与过表达相反。染色质免疫共沉淀结果显示:核内POSTN蛋白可与CollagenⅡDNA启动子区结合来调控CollagenⅡ基因的转录。3.动物实验部分:(1)大鼠关节盥洗液中POSTN蛋白表达随着膝OA进展呈现先升高后降低的趋势(p0.05)(2)大鼠模型FMT检测结果显示,慢性炎症程度由轻到重依次为:假手术组、低/高浓度POSTN蛋白组、生理盐水组、抗POSTN蛋白组。X线结果显示关节退变程度由轻到重依次为:假手术组、低/高浓度POSTN蛋白组、生理盐水组、抗POSTN组。印度墨水染色、番红O染色、渗透试验结果均显示,软骨退变程度由轻到重依次为:假手术组、低/高浓度POSTN蛋白组、生理盐水组、抗POSTN蛋白组,低、高浓度POSTN组未见明显差别。结论:1.人关节软骨组织和关节液中POSTN蛋白表达在正常膝软骨组织和关节液中表达较低,OA早期及中期表达增高,晚期降低;2.POSTN蛋白对人膝软骨细胞具有正性保护作用;一定浓度的POSTN蛋白对体外培养的人关节软骨细胞具有增殖作用;可以抑制软骨细胞早期凋亡;可以维持软骨细胞的表型,可入核调控Collagen-ⅡDNA的转录过程;3.POSTN蛋白与大鼠骺软骨细胞的增殖有关;4.大鼠OA模型注射入POSTN蛋白可延缓膝关节OA的进展,抗POSTN蛋白可促进膝OA的发生;5.POSTN蛋白有望作为一种生物标记物对OA进行早期诊断与治疗。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R684.3

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