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《山西医科大学》 2018年
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MicroRNA-497靶向VEGF调控胶质细胞瘤增殖、侵袭和血管生成的研究

冯富强  
【摘要】:脑胶质细胞瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,恶性胶质细胞瘤的侵袭性和复发率都明显高于颅内其他肿瘤。特别是胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),预后差、易复发,难以完全切除,严重影响患者生活和生存质量,中位生存期仅在1年左右。即使按照当下标准的手术、放疗和化疗等相结合的规范治疗,结局仍然很差,不容乐观。在当前精准医学概念的指导下,传统的肿瘤组织分型正逐步转向以分子遗传特征为基础的新诊断体系,治疗方案也变成针对肿瘤发生发展过程中的关键调节因子,实施精准的靶向治疗。小分子RNA(microRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的内源性非编码分子。microRNA的基因序列位于一般蛋白基因之间甚至蛋白基因内含子部分,由RNA聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ翻译成初始microRNA(primary microRNA)。Pri-microRNA在细胞核内经Drosha/DGCR8蛋白复合体剪切减短至70个核苷酸左右的前体microRNA(precursor microRNA)。通过输出蛋白V运转出核后,pre-microRNA进一步被RNA酶Dicer修饰,最终成为仅长约18-25个核苷酸的成熟microRNA。它们镶嵌在RNA诱导沉默复合体(RISC)体内,当其通过碱基配对原则,与靶基因的m RNA的3’非翻译区结合时,诱导靶基因m RNA降解或阻遏其翻译。每一个microRNA可以调节约200个靶基因表达,能够调节如肿瘤生成这种复杂的过程,具有显著的抗肿瘤潜能。很多研究已经表明microRNA在胶质细胞瘤肿瘤组织和正常对照组织中表达是有差异的,这些microRNA的表达谱有助于对胶质细胞瘤进行进一步的分级。不同患者microRNA表达水平不同,对治疗反应不同,预后和结局也不同。因此microRNA可以针对胶质细胞瘤患者的临床进程进行协助分级、诊断和预测结局。microRNA-497是microRNA-15/16/195/424/497家族中的成员之一,是位于染色体17p13.1上的一个高度保守的microRNA。之前的研究已经证实microRNA-497在许多恶性肿瘤中存在表达下调,如神经母细胞瘤、前列腺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌癌、肝细胞癌、乳腺癌等。人乳腺癌中microRNA-497的表达显著低于非癌性乳腺组织,microRNA-497高表达的乳腺癌患者5年无进展生存和总生存明显好于低表达的患者。单因素和多因素分析均指出低表达microRNA-497是乳腺癌患者较差预后的独立影响因素。Giulia Regazzo等报道胶质母细胞瘤患者血清中microRNA-497的表达显著低于低级别胶质组的患者,认为血清中microRNA-497的表达可以作为一个新型诊断标记应用于临床。但是,microRNA-497在胶质细胞瘤肿瘤组织中的作用是否相同,是否与肿瘤级别,患者生存,预后结局相关尚未可知,是否可作为一个疾病分层指标和治疗靶点,需要行进一步的研究。本研究将从从临床标本、体外研究和体内研究三个方面深入开展以下探索:第一部分:microRNA-497在胶质细胞瘤中的表达及临床意义目的:探讨microRNA-497在人脑胶质细胞瘤组织的表达,分析microRNA-497与胶质细胞瘤临床病理特征的关系,并进一步探讨microRNA-497在胶质细胞瘤中的临床意义。方法:收集并整理实验组胶质细胞瘤临床标本110例以及对照组非瘤性脑组织标本30例。所收集的标本均来自于2005年-2010年间山西医科大学第一附属医院神经外科,所有标本源于的患者及家属均知情并签署实验研究知情同意书,并且本研究已通过山西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。上述所有患者在术前均未接受过放、化疗以及其他的抗肿瘤治疗,术后随访已全部完成,资料完整,平均随访时间为30个月(时间范围2个月-116个月)。RT-PCR方法检测所有实验标本中microRNA-497的表达情况,Cox比例风险模型评估年龄、性别、肿瘤位置、复发率和microRNA-497表达水平与患者总生存期之间的关系。结果:经过RT-PCR方法检测之后,发现microRNA-497大量存在于非瘤性组织内,相对于胶质细胞瘤组织,microRNA-497在非瘤性组织内表达水平较高。研究发现在不同级别的胶质细胞瘤组织内,microRNA-497的表达水平也存在差异。相对于低级别的胶质细胞瘤组织,microRNA-497在高级别的胶质细胞瘤组织内的表达水平显著降低。通过卡方检验(chi-square test)分析、Kaplan-Meier检验分析患者的生存状况和Cox比例风险回归模型进行单变量及多变量分析(当P值小于0.05时认为结果有显著差异),研究发现:microRNA-497的低表达与高级别胶质细胞瘤的患者(P0.001)和低Kamofsky performance评分(P=0.02)显著相关,而与胶质细胞瘤患者的年龄、性别、肿瘤位置和复发率没有明显的联系(P0.05)。microRNA-497低表达组的胶质细胞瘤患者较microRNA-497高表达组,其总生存期明显减少(P0.001);在高级别的胶质细胞瘤患者中,microRNA-497低表达组患者的预后相对于高表达组较差(P0.001),而在低级别胶质细胞瘤患者中则无此现象(P0.05)。结论:相对于低级别的胶质细胞瘤组织,microRNA-497在高级别的胶质细胞瘤组织内的表达水平显著降低。在高级别的胶质细胞瘤患者中,microRNA-497低表达组患者的预后相对于高表达组较差。第二部分:microRNA-497靶向VEGF调控胶质细胞瘤血管生成和侵袭的体外研究目的:采用生物信息学技术查询microRNA-497作用靶点,验证microRNA-497对VEGF的调控作用。观察并探讨microRNA-497在胶质瘤细胞系中对肿瘤血管生成和侵袭的影响和机制。方法:采用生物信息学预测技术(http://www.targetscan.org)预测microRNA-497与VEGF-A的靶向关系,再采用荧光素酶报告系统检测microRNA-497对VEGF的调控作用,确认二者的靶向关系。培养U87MG细胞和HBMVEC细胞,构建过表达microRNA-497的质粒和对照质粒。在U87MG细胞内转染microRNA-497过表达质粒和对照质粒,采用Tube Formation实验检测稳转细胞系(microRNA-497mimics-U87/microRNA-497 nc-U87)对HMBVEC细胞的影响,采用Transwell侵袭实验观察分析microRNA-497对胶质瘤细胞侵袭能力的影响,采用Western blot检测VEGF在microRNA-497 mimics-U87和microRNA-497 nc-U87细胞中的表达情况。结果:生物信息学技术预测microRNA-49与VEGF-A有靶向关系,双荧光素酶检测显示,联合转染的microRNA-497与野生型VEGFA的3′-UTR结合,显著抑制荧光报告活性,而与突变型VEGFA的3′-UTR结合时,抑制作用不明显。采用稳定转染过表达microRNA-497的U87MG细胞系与人脑微血管内皮细胞(HBMVEC)共培养,发现过表达microRNA-497可以诱导HBMVEC形态分化,显著减少管腔样结构分支点的数目,管腔形成结构不全,周围存在散在细胞。Western blot分析显示过表达microRNA-497组U87MG细胞中VEGF表达水平显著降低(P0.05)。Transwell实验分析显示在显微镜下观察到过表达microRNA-497组的U87MG细胞侵袭能力较对照组明显降低(P0.05)。结论:microRNA-497可以靶向调控VEGF,在体外U87MG细胞抑制VEGF的表达,显著减少HBMVEC管腔结构形成,明显抑制U87MG细胞的侵袭能力。第三部分:microRNA-497抑制胶质细胞瘤增殖及血管生成的体内研究目的:动物学实验明确过表达microRNA-497对体内成瘤的影响,同时验证成瘤细胞中增殖和血管生成指标变化,明确microRNA-497对肿瘤增殖和血管生成的影响。方法:取稳转胶质瘤细胞系microRNA-497 mimics-U87和microRNA-497 nc-U87以及正常培养的胶质瘤细胞U87MG细胞悬液,注射入裸小鼠右下肢外侧皮下组织。肿瘤生长至第25天,处死成瘤鼠,剥离肿瘤组织,测量称重。采用免疫组化染色方法分析Ki-67、VEGF和CD34在不同分组的成瘤组织标本中的表达情况。结果:注射microRNA-497 mimics-U87细胞的成瘤组,其肿瘤大小较microRNA-497nc-U87细胞组和U87MG细胞组明显缩小(P0.05),而microRNA-497 nc-U87细胞组和U87MG细胞组之间,肿瘤的大小无显著差异。免疫组化分析显示microRNA-497mimics-U87组中,Ki-67、VGEF、CD34的表达水平较microRNA-497 nc-U87组和U87MG组显著降低(P0.05),而microRNA-497 nc-U87组和U87MG组之间未见明显差异。结论:microRNA-497过表达可显著抑制U87MG细胞在裸鼠体内成瘤效应,降低肿瘤细胞增殖活性和血管生成能力。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R739.4

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