收藏本站
《山西医科大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

经典型蛋白激酶C亚型对低氧诱导的小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制探讨

曾超  
【摘要】:目的:肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的过度增殖是低氧性肺动脉高压(HPH)所致肺血管重塑的基础病理变化,特别是远端肺小动脉的结构改变对HPH的发生发展具有重要意义。而低氧、多种生长因子等因素通过细胞内信号转导通路参与了细胞异常增殖过程的启动和调控。探明其病理发生机制,找到可能逆转HPH所致血管重塑的治疗靶点意义重大。近年来,基于蛋白激酶转导通路的调控受到广泛关注。在对蛋白激酶的相关研究中,发现经典型蛋白激酶C(cPKC)与低氧诱导的PASMCs异常增殖和HPH可能相关。此外,随着小鼠基因动物模型应用于肺动脉高压疾病研究,建立稳定的小鼠远端PASMCs原代培养技术是细胞分子水平实验研究的基础。那么,关于cPKC各亚型是否参与和调控低氧诱导下的PASMCs异常增殖?目前尚不清楚。鉴于以上背景,本实验主要研究:1.借鉴国外的PASMCs磁性分离培养方法,并加以改良,探讨建立稳定的小鼠远端PASMCs原代培养技术。2.利用原代培养的小鼠远端PASMCs建立低氧模型,探讨低氧对PASMCs增殖及cPKC各亚型表达的影响。3.通过药物干预或病毒转染体外原代培养的小鼠远端PASMCs,探讨cPKC特定亚型对低氧诱导的细胞增殖及ERK1/2、Akt表达的影响。方法:1.利用Dynal MPC-1磁分离器分离含铁粉的远端肺小动脉血管,进行细胞的原代培养;显微镜下观察细胞形态,并通过平滑肌细胞smoothelin多克隆抗体和myosin heavy chain多克隆抗体对培养的细胞进行免疫荧光双染色法鉴定。2.用cPKC各亚型特异性抗体,采用免疫印迹、免疫荧光技术鉴定cPKC各亚型在正常小鼠PASMCs上的表达情况。3.对正常小鼠PASMCs进行低氧(O_2浓度3%)培养,建立细胞缺氧模型。4.采用CCK法和Brdu法检测常氧和低氧条件下细胞增殖能力变化。5.采用免疫荧光技术、免疫印迹技术、间接免疫荧光流式细胞技术检测常氧和低氧条件下不同时相点cPKC亚型蛋白表达变化。6.应用PKC激动剂(PMA)、PKCα抑制剂(safingol)、PKCβI抑制剂(Go6976)、PKCβII抑制剂(LY333531)分别干预细胞后,在常氧和低氧条件下,采用免疫印迹法观察cPKC亚型蛋白表达变化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平变化。7.应用PKCα、PKCβ的慢病毒载体,通过病毒转染技术特异性敲减目标基因活性,采用免疫印迹法观察低氧诱导小鼠PASMCs中cPKC亚型蛋白表达变化,以及ERK1/2、Akt磷酸化水平变化。结果:1.经细胞形态学、平滑肌细胞标记物smoothelin和myosin heavy chain免疫荧光鉴定,证实从小鼠远端肺动脉原代培养的细胞是平滑肌细胞。2.经改良后,采用磁分离原理对小鼠远端PASMCs进行分离和原代培养技术具有操作难度低、重复性好的特点,并能获得稳定的高纯度小鼠PASMCs系。3.通过免疫印迹技术、免疫荧光技术,均检测到cPKCα(75 kDa)、cPKCβI(77 kDa)和cPKCβII(77 kDa)在小鼠PASMCs中表达,而cPKCγ(78 kDa)没有检测到。4.采用CCK法和Brdu法,检测到经低氧和常氧培养24h、48h、72h后,小鼠PASMCs中的CCK吸光度值和Brdu阳性细胞率均较常氧组显著增高,其中低氧72h时相点细胞的增殖能力提高最明显。5.采用免疫荧光技术定性分析,发现经低氧培养24h、48h、72h后,cPKCα的蛋白表达较常氧组均明显增高;cPKCβI、βII的蛋白表达在低氧培养48h、72h后均高于常氧组。6.采用免疫印迹技术、流式细胞技术的定量分析,均检测到cPKCα、βI、βII的蛋白表达在低氧培养24h、48h、72h各时相点明显高于常氧组。7.采用Brdu法,检测到用safingol、Go6976、LY333531分别抑制cPKCα、βI和βII时,低氧诱导的PASMCs增殖能力受到明显抑制,我们还观察到PMA在常氧条件下可显著促进PASMCs的增殖能力;此外经过PKCα、PKCβ的慢病毒载体转染细胞后,也发现低氧转染组的PASMCs增殖能力较空载对照组明显下降。8.通过免疫印迹技术还观察到,用safingol、Go6976、LY333531分别抑制cPKCα、βI和βII表达后,低氧诱导的PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平较对照组显著降低,PMA可使常氧条件下PASMCs中ERK1/2、Akt的磷酸化水平增高;我们还利用病毒转染技术对cPKCα、β的表达进行特异性敲减,发现低氧条件下,转染细胞后均可使细胞中ERK1/2磷酸化水平显著降低,而Akt磷酸化水平较对照组无明显变化。结论:1.本实验通过改良后的磁性分离方法成功的进行了小鼠远端PASMCs的原代培养,获得的细胞纯度及存活率高,可用于下一步实验。解决了远端肺小动脉取材困难的难点,该方法可操作性强,重复性好。2.本实验验证了低氧可诱导小鼠远端PASMCs的过度增殖。3.验证了在小鼠PASMCs上存在cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的表达,而没有cPKCγ的表达。4.低氧可上调小鼠远端PASMCs中cPKCα、cPKCβI和cPKCβII的蛋白表达,低氧诱导小鼠远端PASMCs的异常增殖可能是通过上调cPKCα、βI和βII信号通路来调控的。5.药物干预或者病毒转染可使PASMCs中cPKCα、βI和βII表达下降,可显著抑制低氧诱导的小鼠远端PASMCs异常增殖,其作用机制可能与cPKCα、βI和βII蛋白表达上调有关。6.低氧可能通过上调cPKCα、βI和βII的蛋白表达,使得ERK1/2磷酸化水平增高,最终引起小鼠远端PASMCs的异常增殖,参与HPH的形成过程。7.调控cPKCα、βI和βII的表达可能有利于改善肺血管重塑的形成,基于cPKC亚型的靶向治疗可望成为今后HPH治疗的新方向。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R544.1

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐海军;张存娟;张娟;吴海霞;苏慧;张海峰;孙新;;脂联素改善低氧诱导的大鼠肺微血管内皮细胞功能障碍及机制研究[J];心脏杂志;2017年05期
2 王琼;卢慕峻;;低氧诱导成体干细胞血管化[J];组织工程与重建外科杂志;2015年04期
3 杨 姗,李冠胜,陈雪梅;自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用[J];重庆医科大学学报;年期
4 殷爱红;武文琦;何丽明;郑少鹏;;低氧诱导人VEGF基因表达载体的构建及其蛋白表达检测[J];山东医药;2011年52期
5 刘江;吴巍;何卫美;朱伟华;刘春燕;董权;邹伟华;李伟平;;低氧诱导的非酒精性脂肪性肝炎动物模型的构建[J];浙江医学;2014年07期
6 李兵;赵黎明;王海青;王桂芳;修清玉;;低压低氧诱导大鼠阻塞性睡眠呼吸暂停综合征后咽部肌肉结构和功能的改变[J];第二军医大学学报;2006年04期
7 杨姗;李冠胜;陈雪梅;;自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用[J];重庆医科大学学报;2018年03期
8 于加倍;胡扬;李燕春;梅涛;韩天雨;白学成;付鹏宇;朱镕鑫;车欣媛;;4周爬梯抗阻训练对低氧诱导大鼠骨骼肌萎缩的影响[J];中国实验动物学报;年期
9 杨磊;郑金旭;史小东;钱海;孙金玲;;丹参酮ⅡA磺酸钠抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及其机制[J];江苏大学学报(医学版);2018年03期
10 庞静雯;吴亚霖;徐婷;庄秀妹;;低氧诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡的研究[J];中华临床医师杂志(电子版);2017年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 师永红;王玉湘;宫丽华;吴岩;石艳春;方伟岗;;bFGF和低氧诱导VEGF分泌的作用机制及其信号通路[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年
2 康裕建;;铜离子调节低氧诱导转录因子活性的机制及应用[A];第八届全国医学生物化学与分子生物学第五届全国临床应用生物化学与分子生物学2013华东六省一市生物化学与分子生物学联合学术研讨会论文汇编[C];2013年
3 王嫱;顾镭;王艳艳;沈友轩;张缪佳;;Stats激活对低氧诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响[A];第17次全国风湿病学学术会议论文集[C];2012年
4 刘婷;李运成;贺斌峰;王关嵩;;S100A4/Mts1在低氧诱导肺动脉平滑肌中的作用机制[A];中华医学会呼吸病学年会——2011(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编[C];2011年
5 尚俊依;李尔然;王秋月;康健;;低氧诱导AQP1表达的分子机制[A];中华医学会呼吸病学年会——2011(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编[C];2011年
6 聂欣;施熠炜;许建英;杜永成;;KLF4在低氧诱导肺动脉平滑肌细胞增殖及表型转化中的作用研究[A];中华医学会呼吸病学年会——2013第十四次全国呼吸病学学术会议论文汇编[C];2013年
7 杜继曾;陈学群;;CRFR1受体调节低氧诱导的脑-内分泌-免疫网络反应[A];2008年神经内分泌暨神经免疫内分泌学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
8 梁燕;缪冉;王望;王颖;黄骁舾;王军;王辰;;抑制Notch3通过降低库容性钙内流抑制低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖[A];中华医学会呼吸病学年会——2013第十四次全国呼吸病学学术会议论文汇编[C];2013年
9 陈锐;刘春风;;慢性间歇低氧诱导小鼠学习记忆障碍的机制探讨[A];中华医学会呼吸病学年会——2011(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编[C];2011年
10 顾镭;王嫱;梅焕平;沈友轩;张缪佳;;自体吞噬抑制剂3-MA对低氧诱导肺动脉内皮细胞凋亡的影响[A];第17次全国风湿病学学术会议论文集[C];2012年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 汪敏 章米力;低氧诱导白血病细胞分化[N];健康报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蒋蕊;新奇型蛋白激酶C在低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用和机制研究[D];山西医科大学;2018年
2 曾超;经典型蛋白激酶C亚型对低氧诱导的小鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制探讨[D];山西医科大学;2018年
3 范亮;低氧诱导的肺癌局部肾素—血管紧张素系统失衡及其对肺癌侵袭影响研究[D];上海交通大学;2012年
4 郭黎;低氧诱导通路相关基因的单核苷酸多态性和急性高山病的关联研究[D];第三军医大学;2015年
5 张卫芳;LOX-1在低氧诱导肺动脉高压肺血管重构中的作用及机制[D];中南大学;2013年
6 李强;低氧诱导成骨细胞增殖分化两种机制的研究[D];南方医科大学;2016年
7 常莹;MiR-375在低氧诱导的肝癌细胞自噬中的作用和机制研究[D];华中科技大学;2012年
8 吕顺艳;血管钠肽对低氧诱导的心肌细胞、心成纤维细胞以及血管平滑肌细胞生长的抑制调节[D];第四军医大学;2002年
9 孙庆佳;周期性低氧诱导喉癌细胞化疗抵抗的作用机制[D];吉林大学;2012年
10 陆晔斌;低氧诱导胰腺癌免疫逃逸机制及相关信号通路的初步研究[D];中南大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孟威;低氧诱导雪旺细胞AQP1表达机制的相关实验研究[D];第二军医大学;2017年
2 李彩霞;青心酮对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响[D];南华大学;2013年
3 于文燕;蛋白激酶Cα在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用机制[D];山西医科大学;2013年
4 王凡;低氧诱导的miR-147a通过靶向HIF-3α影响细胞增殖[D];清华大学;2016年
5 李东峰;MicroRNA-24抑制低氧诱导心肌细胞凋亡的初步研究[D];第二军医大学;2009年
6 董小铷;HUMMR在低氧诱导神经元线粒体损伤中的作用研究[D];第四军医大学;2015年
7 张霖;MiR-206在低氧诱导心肌细胞凋亡过程中的作用及其机制研究[D];宁波大学;2017年
8 王授衔;低氧诱导内皮细胞Brm表达上调的机制研究[D];第三军医大学;2017年
9 徐海军;脂联素改善低氧诱导的大鼠肺微血管内皮细胞功能障碍及其机制[D];第四军医大学;2017年
10 王育铮;阿托伐他汀抑制低氧诱导的神经干细胞内质网应激[D];南华大学;2017年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026