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《山西医科大学》 2018年
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西酞普兰减轻阿尔茨海默病三转基因小鼠认知功能障碍的实验研究

张炜  
【摘要】:目的:观察西酞普兰(citalopram)对3xTgAD小鼠认知功能障碍的改善作用,探讨西酞普兰神经保护作用的可能机制。方法:将5月龄雌性三转基因(3xTg)阿尔茨海默病(AD)小鼠与野生型小鼠(wild type,WT)随机分为以下四组:野生型对照组(WT+Water)、野生型治疗组(WT+Citalopram)、转基因对照组(3xTgAD+Water)和转基因治疗组(3xTgAD+Citalopram)。每组小鼠11-12只。从5月龄起在小鼠饮水中加入或不加入药物西酞普兰(浓度0.06mg/ml),小鼠经饮水摄入药物,共持续3个月。小鼠从7月龄起开始进行行为学实验:(1)旷场实验将小鼠置于旷场中央,让其自由探索5分钟,记录小鼠运动距离及中央区域探索时间;(2)Y迷宫自发交替实验将小鼠置于三臂交汇处,自由探索8 min,记录小鼠进臂的总次数以及每次进臂的顺序,计算小鼠进臂正确率;(3)Morris水迷宫实验分为定位航行试验和空间探索试验两部分,分别记录小鼠寻找平台的逃避潜伏期、穿过平台所在位置的次数;(4)高架十字迷宫实验将小鼠置于迷宫中,令其自由活动5min,记录其移动的总距离及在开放臂中停留的时间;(5)悬尾实验将小鼠尾巴悬挂在钩上5min,记录小鼠不动时间。行为学实验结束后,每组小鼠随机取6只进行在体海马长时程增强(LTP)实验。腹腔水合氯醛麻醉小鼠,将其固定于脑立体定位仪上。在颅骨上钻孔,将同心圆刺激电极置于海马Schaffer侧枝/联合纤维通路上,记录电极置于海马CA1区。使用电刺激器及配套的隔离器产生电刺激信号,记录电极拾取海马CA1区放射层兴奋性突触后电位(fEPSPs),经多道生理信号采集处理系统放大。先给予每30秒1次的测试刺激至少15min,以得到稳定的基础性突触传递。然后,使用高频刺激(HFS)诱导fEPSPs的LTP。HFS之后,继续记录fEPSPs,持续至少1h。将HFS后的fEPSPs斜率相对基础水平斜率进行标准化,绘制fEPSPs斜率变化与时间的关系曲线,并计算各组小鼠HFS后0-10min和21-60min的曲线下面积(AUC)。HFS之前进行双脉冲易化(PPF)实验,分析突触前功能变化。电生理实验结束后,取小鼠海马及大脑皮层新鲜组织进行分子生物学实验:(1)ELISA实验使用ELISA方法测量3xTgAD小鼠海马及皮层Aβ含量,根据ELISA试剂盒的说明书操作;(2)Western blot实验使用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白,转至PVDF膜,使用一抗结合APP、CTFβ及β-actin,二抗结合一抗后用ECL显色,用Image J分析。实验使用双因素方差分析或三因素重复测量方差分析进行多个均数的比较。使用t检验比较两组均数间的差异。P0.05被认为具有统计学意义。结果:(1)旷场实验:3xTgAD小鼠运动距离小于WT小鼠(P0.001),西酞普兰可增加WT小鼠的运动距离(P=0.017),但不影响转基因小鼠的运动距离(P=0.123);3xTgAD小鼠较WT小鼠在旷场中央停时间明显增多(P=0.009),西酞普兰对WT(P=0.308)和3xTgAD小鼠(P=0.290)在中央区的探索时间均无影响。(2)高架十字迷宫实验:3xTgAD小鼠运动距离小于WT小鼠(P=0.003),西酞普兰对WT小鼠(P=0.106)与3xTgAD小鼠(P=0.827)的运动距离都无影响;3xTgAD小鼠在开放臂停留时间较WT小鼠明显延长(P=0.012),但西酞普兰并未影响WT(P=0.387)与3xTgAD小鼠(P=0.184)在开放臂的停留时间。(3)悬尾实验:各组小鼠不动时间没有显著差异(P0.05)。(4)Y迷宫自发交替实验:3xTgAD小鼠的进臂次数少于WT小鼠(P0.001),西酞普兰不影响WT(P=0.395)及3xTgAD小鼠(P=0.925)的进臂次数;各组小鼠进臂正确率无统计学差异(P0.05)。(5)Morris水迷宫实验:在定位航行试验中,各组小鼠的逃避潜伏期随着训练天数的增加而缩短(P0.001);在5天训练过程中,3xTgAD小鼠的逃避潜伏期明显长于WT小鼠(P0.05),西酞普兰能明显缩短3xTgAD小鼠延长的逃避潜伏期(P0.05);在空间探索试验中,3xTgAD小鼠穿越平台次数明显少于WT小鼠(P=0.004),西酞普兰能显著增加3xTgAD小鼠穿越平台次数(P=0.003)。(6)在体海马LTP记录:各组小鼠0-10min AUC之间不存在统计学差异(P0.05);3xTgAD小鼠21-60min AUC明显低于WT小鼠(P=0.010);西酞普兰治疗后3xTgAD小鼠21-60minAUC明显增加(P=0.047);各组小鼠fEPSP2/fEPSP1比值没有统计学差异(P0.05)。(7)ELISA实验:3xTgAD小鼠海马及皮层组织可溶性Aβ含量由于低于ELISA试剂盒的检测下限而未得出有意义的结果;转基因小鼠经西酞普兰治疗后海马、大脑皮层不溶Aβ_(40)含量显著低于未治疗组(P=0.018,P=0.0348);西酞普兰治疗与否不影响3xTgAD小鼠海马及大脑皮层不溶Aβ_(42)的含量(P0.05)。(8)Western blot实验:3xTgAD小鼠海马组织APP、CTFβ含量高于WT小鼠(P=0.001,P0.001),西酞普兰能显著降低3xTgAD小鼠海马APP、CTFβ水平(P=0.018,P=0.023)。结论:(1)7-8月龄雌性3xTgAD小鼠工作记忆正常,但空间学习记忆能力明显受到伤害;慢性经口给予西酞普兰可改善3xTgAD小鼠的空间学习记忆能力。(2)7-8月龄雌性3xTgAD小鼠表现出淡漠样、去抑制样行为,西酞普兰对上述精神行为异常无效;7-8月龄雌性3xTgAD转基因小鼠未表现出抑郁样行为;(3)西酞普兰慢性经口给药能减轻雌性3xTgAD小鼠海马CA1区突触可塑性伤害;(4)西酞普兰慢性经口给药能减少雌性3xTgAD小鼠海马及皮层组织Aβ含量,这种减少可能是通过下调APP的表达或增强α分泌酶活性而实现的。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R749.16

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